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La mesure de l’absorbance d’une solution d’acide nucléique à seulement quatre longueurs d’onde est suffisante pour déterminer sa concentration et obtenir un aperçu de sa pureté.

Source de l’image : DRogatnev/shutterstock.com

Les acides nucléiques sont isolés à partir d’échantillons tels que des cellules et ensuite utilisés dans d’autres expériences de laboratoire. A cet effet, il convient de déterminer la concentration de l’ADN ou de l’ARN purifié ainsi que de vérifier leur pureté. De cette manière, des quantités définies avec précision de l’acide nucléique entreront dans l’application en aval, et toute contamination susceptible d’avoir un impact sur une réaction ou un test sensible est détectée en temps réel.

La spectrophotométrie UV-Vis est une méthode simple, rapide et éprouvée pour atteindre ces objectifs. Dans la gamme de 260 nm, les acides nucléiques présentent un pic d’absorbance caractéristique (figure 1). Cette valeur d’absorbance est donc utilisée pour calculer les concentrations d’acides nucléiques. Selon la loi de Lambert-Beer, deux paramètres sont nécessaires pour le calcul de la concentration d’un échantillon : la longueur du trajet optique (= longueur du trajet lumineux (L)) et le coefficient d’extinction molaire (constante spécifique au matériau et à la longueur d’onde) du échantillon à mesurer. Le facteur spécifique (F) peut être calculé lors de l’utilisation d’une cuvette standard avec un trajet lumineux de 1 cm. Ce facteur est ensuite multiplié par la valeur d’absorbance mesurée (A) pour arriver à la concentration (C) de la solution d’échantillon. Les coefficients d’extinction molaire et les facteurs spécifiques, respectivement, sont généralement disponibles dans la littérature. Le facteur pour l’ADNdb, par exemple, est de 50 µg/mL (ARN : 40 µg/mL), et il est par définition équivalent à une unité d’absorbance. ces données.

Loi de Lambert-Beer :

C = A/(L x Ɛ )
F = 1/Ɛ (pour un trajet lumineux de 1 cm)

– C = A x F
C = concentration
A = Absorbance
L = longueur du trajet optique (lumière)
Ɛ = coefficient d’extinction molaire
(spécifique à l’échantillon et à la longueur d’onde)
F = Facteur
Figure 1 : Spectre d’absorbance des acides nucléiques avec des longueurs d’onde pertinentes et un exemple décrivant le calcul de la concentration d’un échantillon d’ADNdb.

Afin de pouvoir se prononcer sur la pureté d’un échantillon d’acide nucléique, l’absorbance à des longueurs d’onde autres que 260 nm doit être déterminée (figure 1). Les quotients issus des valeurs d’absorbance mesurées à 260 nm, 280 nm et 230 nm (A 260 /A 280 et A 260 /A 230 ) constituent les rapports de pureté qui permettent d’identifier d’éventuelles contaminations. Les impuretés telles que les protéines et les traces de réactifs qui ont été utilisées pendant le processus de purification donnent un spectre d’absorbance différent de celui des acides nucléiques et influencent ainsi les rapports de pureté (figure 2). Le rapport A260 / A280 des solutions d’acides nucléiques purs sera approximativement de 1,8 à 2,0, tandis que le rapport A260 / A230 affichera typiquement des valeurs dans la plage de 2,0 à 2,5.

Figure 2 : Spectres d’absorbance des acides nucléiques et des contaminants possibles

Une quatrième longueur d’onde est utilisée pour déterminer le bruit de fond. Elle est mesurée à ou au-dessus de 320 nm car ni les acides nucléiques ni les contaminants organiques n’absorbent la lumière à cette longueur d’onde. L’absorbance mesurée dans cette plage peut indiquer la présence de particules ou de bulles d’air dans l’échantillon. Même une cuvette tachée est capable d’obtenir une lecture de fond. Les photomètres modernes offrent la possibilité d’activer une fonction de correction de fond qui effectuera une soustraction automatique de toute absorbance de fond de toutes les autres valeurs mesurées.

De plus, le spectre complet d’un échantillon d’acide nucléique peut être capturé (typiquement entre 220 et 320 nm). Des comparaisons avec le spectre obtenu à partir d’une solution d’acide nucléique pur permettront de détecter d’éventuelles erreurs lors du processus de mesure ainsi que la présence de contaminants dans l’échantillon.

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