This post is also available in: English (Engels) Français (Frans) polski (Pools) Español (Spaans) Български (Bulgaars) Čeština (Tsjechisch) Esperanta (Esperanto) Eesti (Ests) Deutsch (Duits) Gaeilge (Iers) Italiano (Italiaans) 한국어 (Koreaans) Melayu (Malay) Norsk bokmål (Noors Bokmål) Português (Portugees, Portugal) Svenska (Zweeds)

De absorptiemeting van een nucleïnezuuroplossing bij slechts vier golflengten is voldoende om de concentratie te bepalen en inzicht te krijgen in de zuiverheid ervan.

Afbeeldingsbron: DRogatnev/shutterstock.com

Nucleïnezuren worden geïsoleerd uit monstermateriaal zoals cellen en vervolgens gebruikt in verdere laboratoriumexperimenten. Voor dit doel is het raadzaam om de concentratie van het gezuiverde DNA of RNA te bepalen en de zuiverheid ervan te verifiëren. Op deze manier komen nauwkeurig gedefinieerde hoeveelheden van het nucleïnezuur de stroomafwaartse toepassing binnen en worden eventuele verontreinigingen die een gevoelige reactie of test kunnen beïnvloeden, in realtime gedetecteerd.

UV-Vis-spectrofotometrie is een gemakkelijke, snelle en beproefde methode om deze doelstellingen te bereiken. In het bereik van 260 nm vertonen nucleïnezuren een karakteristieke absorptiepiek (figuur 1). Deze absorptiewaarde wordt daarom gebruikt om nucleïnezuurconcentraties te berekenen. Volgens de wet van Lambert-Beer zijn twee parameters vereist voor de berekening van de concentratie van een monster: de optische weglengte (= lichtweglengte (L)) en de molaire extinctiecoëfficiënt (materiaal- en golflengtespecifieke constante) van de monster te meten. De specifieke factor (F) kan worden berekend bij gebruik van een standaard kuvet met een lichtpad van 1 cm. Deze factor wordt vervolgens vermenigvuldigd met de gemeten absorptiewaarde (A) om te komen tot de concentratie (C) van de monsteroplossing. Molaire extinctiecoëfficiënten en specifieke factoren zijn typisch beschikbaar in de literatuur. De factor voor dsDNA is bijvoorbeeld 50 µg/mL (RNA: 40 µg/mL) en is per definitie gelijk aan één absorptie-eenheid. deze data.

Lambert-Beer wet:

C = A/(L x )
F = 1/Ɛ (voor een lichtpad van 1 cm)

– C = A x F
C = Concentratie
A = Absorptie
L = optische (licht) padlengte
Ɛ = Molaire extinctiecoëfficiënt
(monster- en golflengtespecifiek)
F = Factor
Figuur 1: Absorptiespectrum van nucleïnezuren met relevante golflengten en een voorbeeld dat de berekening van de concentratie van een dsDNA-monster beschrijft.

Om een uitspraak te kunnen doen over de zuiverheid van een nucleïnezuurmonster, moet de absorptie bij andere golflengten dan 260 nm worden bepaald (figuur 1). De quotiënten afgeleid van de absorptiewaarden gemeten bij 260 nm, 280 nm en 230 nm ( A260 / A280 en A260 / A230 ) vormen de zuiverheidsverhoudingen die helpen bij het identificeren van mogelijke verontreinigingen. Onzuiverheden zoals eiwitten en sporen van reagentia die tijdens het zuiveringsproces zijn gebruikt, geven een ander absorptiespectrum dan dat van nucleïnezuren en beïnvloeden zo de zuiverheidsverhoudingen (figuur 2). De verhouding A260 / A280 van zuivere nucleïnezuuroplossingen zal ongeveer 1,8-2,0 zijn, terwijl de verhouding A260 /A230 typisch waarden in het bereik van 2,0-2,5 zal vertonen.

Figuur 2: Absorptiespectra van nucleïnezuren en mogelijke verontreinigingen

Een vierde golflengte wordt gebruikt om de achtergrond te bepalen. Het wordt gemeten bij of boven 320 nm, aangezien noch nucleïnezuren noch organische verontreinigingen licht absorberen bij deze golflengte. Absorptie gemeten in dit bereik kan wijzen op de aanwezigheid van deeltjes of luchtbellen in het monster. Zelfs een besmeurde cuvet kan een achtergrondaflezing opwekken. Moderne fotometers bieden de mogelijkheid om een achtergrondcorrectiefunctie te activeren die ervoor zorgt dat eventuele achtergrondabsorptie automatisch wordt afgetrokken van alle andere meetwaarden.

Bovendien kan het volledige spectrum van een nucleïnezuurmonster worden ingevangen (typisch tussen 220 en 320 nm). Vergelijkingen met het spectrum verkregen uit een zuivere nucleïnezuuroplossing zullen de detectie van mogelijke fouten tijdens het meetproces en de aanwezigheid van verontreinigingen in het monster mogelijk maken.

Bron

Geef een reactie

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *