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A medição da absorvância de uma solução de ácido nucleico em apenas quatro comprimentos de onda é suficiente para determinar a sua concentração e obter uma visão da sua pureza.
Fonte de imagem: DRogatnev/shutterstock.com
Os ácidos nucleicos são isolados de materiais de amostra, tais como células e subsequentemente utilizados em outras experiências laboratoriais. Para o efeito, é aconselhável determinar a concentração do ADN ou do RNA purificados, bem como verificar a sua pureza. Desta forma, quantidades definidas com precisão do ácido nucleico entrarão na aplicação a jusante, e quaisquer contaminações que possam ter impacto numa reação ou ensaio sensível são detetadas em tempo real.
A espectrofotometria UV-Vis é um método fácil, rápido e testado no tempo para atingir estes objetivos. Na gama de 260 nm, os ácidos nucleicos apresentam um pico de absorvância característico (figura 1). Este valor de absorvância é, portanto, utilizado para calcular as concentrações de ácidos nucleicos. De acordo com a lei Lambert-Beer, são necessários dois parâmetros para o cálculo da concentração de uma amostra: o comprimento do percurso ótico (= comprimento do caminho leve (L) e o coeficiente de extinção molar (constante específica do material e do comprimento de onda) da amostra a medir. O fator específico (F) pode ser calculado quando se utiliza uma cuvette padrão com um caminho leve de 1 cm. Este fator é então multiplicado pelo valor de absorvância medido (A) a fim de chegar à concentração (C) da solução da amostra. Os coeficientes de extinção molar e os fatores específicos, respectivamente, estão tipicamente disponíveis na literatura. O fator para o dsDNA, por exemplo, é de 50 μg/mL (RNA: 40 μg/mL), e é por definição equivalente a uma unidade de absorvância. estes dados.
| Lei Lambert-Beer: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (para um caminho leve de 1 cm) – C = A x F | C = Concentração A = Absorção L = Comprimento do caminho ótico (leve) Ɛ = Coeficiente de extinção molar (amostra e comprimento de onda específico) F = Fator |
Para poder fazer uma declaração sobre a pureza de uma amostra de ácido nucleico, é necessário determinar a absorvância em comprimentos de onda que não sejam de 260 nm (figura 1). Os quocientes derivados dos valores de absorvância medidos a 260 nm, 280 nm e 230 nm (A260/A280 e A260/A230) constituem os rácios de pureza que ajudam a identificar possíveis contaminações. Impurezas como proteínas e vestígios de reagentes que foram utilizados durante o processo de purificação produzem um espectro de absorvância diferente do dos ácidos nucleicos e, assim, influenciam os rácios de pureza (figura 2). A relação A260/A280 das soluções de ácido nucleico puro será aproximadamente de 1,8 – 2,0, enquanto a razão A260/A230 apresentará tipicamente valores na gama de 2,0 – 2,5.
Um quarto comprimento de onda é usado para determinar o fundo. Mede-se a 320 nm ou acima de 320 nm, uma vez que nem ácidos nucleicos nem contaminantes orgânicos absorvem a luz neste comprimento de onda. A absorvância medida neste intervalo pode indicar a presença de partículas ou bolhas de ar dentro da amostra. Até uma cuvette borrada é capaz de provocar uma leitura de fundo. Os fotometros modernos oferecem a opção de ativar uma função de correção de fundo que irá afetar a subtração automática de qualquer absorvância de fundo de todos os outros valores medidos.
Além disso, pode ser capturado o espectro completo de uma amostra de ácido nucleico (normalmente entre 220 e 320 nm). As comparações com o espectro obtido a partir de uma solução de ácido nucleico puro permitirão a deteção de possíveis erros durante o processo de medição, bem como a presença de contaminantes dentro da amostra.
