This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English (English) 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (German) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
Is leor tomhas ionsúcháin tuaslagáin aigéid núicléigh ag ceithre thonnfhad amháin chun a thiúchan a chinneadh agus chun léargas a fháil ar a íonacht.
Foinse íomhá: DRogatnev/shutterstock.com
Déantar aigéid núicléacha a leithlisiú ó ábhar samplach ar nós cealla agus úsáidtear iad ina dhiaidh sin i dturgnaimh saotharlainne breise. Chun na críche sin, tá sé inmholta tiúchan an DNA íonaithe nó RNA a chinneadh chomh maith lena n-íonacht a fhíorú. Ar an mbealach seo, cuirfidh méideanna atá sainithe go cruinn an aigéid núicléigh isteach san iarratas le sruth, agus aimsítear aon éilliúcháin a d’fhéadfadh tionchar a bheith acu ar imoibriú íogair nó ar mheasúnú i bhfíor-am.
Is modh é speictrophotiméadracht UV-Vis atá éasca, gasta agus a ndéantar tástáil ama air chun na cuspóirí seo a bhaint amach. Sa raon 260 nm, léiríonn aigéid núicléacha buaic tréith ionsúcháin (figiúr 1). Úsáidtear an luach ionsúcháin seo mar sin chun tiúchain aigéid núicléigh a ríomh. De réir dhlí Lambert-Beer, tá gá le dhá pharaiméadar chun tiúchan an tsampla a ríomh: fad an chosáin optúil (= fad cosán solais (L)) agus comhéifeacht díothaithe molar (tairiseach ar leith ábhar agus tonnfhad) den sampla le tomhas. Is féidir an fachtóir sonrach (F) a ríomh nuair a úsáidtear cuvette caighdeánach le cosán solais 1 cm. Déantar an fachtóir seo a iolrú ansin faoin luach ionsúite tomhaiste (A) chun tiúchan (C) an tuaslagáin samplach a bhaint amach. Is gnách go mbíonn comhéifeachtaí díothaithe mólar agus fachtóirí sonracha, faoi seach, ar fáil sa litríocht. Is é an fachtóir do dsDNA, mar shampla, ná 50 µg/mL (RNA: 40 µg/mL), agus de réir sainmhínithe is ionann é agus aonad ionsúcháin amháin. na sonraí seo.
| Dlí Lambert-Beoir: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (le haghaidh cosán solais 1 cm) – C = A x F | C = Tiúchan A = Ionsú L = Fad cosáin optúla (éadrom). Ɛ = Comhéifeacht díothaithe molar (sampla agus tonnfhad-shonrach) F = fachtóir |
Chun a bheith in ann ráiteas a dhéanamh faoi íonacht sampla aigéid núicléigh, ní mór an t-ionsúchtadh ag tonnfhaid seachas 260 nm a chinneadh (figiúr 1). Is ionann na comhrannáin a dhíorthaítear ó na luachanna ionsúcháin arna dtomhas ag 260 nm, 280 nm agus 230 nm (A 260 /A 280 agus A 260 /A 230 ) agus na cóimheasa íonachta a chabhraíonn le héilliúcháin fhéideartha a aithint. Tugann neamhíonachtaí cosúil le próitéiní agus rianta imoibrithe a úsáideadh le linn an phróisis íonúcháin speictream ionsúcháin difriúil ó speictream aigéid núicléacha agus mar sin bíonn tionchar acu ar na cóimheasa íonachta (figiúr 2). Beidh an cóimheas A 260 /A 280 de thuaslagáin aigéid núicléigh íon thart ar 1.8 – 2.0, ach go hiondúil léireoidh an cóimheas A 260 /A 230 luachanna sa raon 2.0 – 2.5.
Úsáidtear ceathrú tonnfhad chun an cúlra a chinneadh. Déantar é a thomhas ag 320 nm nó os a chionn toisc nach n-ionsúnn aigéid núicléacha ná ábhair shalaithe orgánacha solas ag an tonnfhad seo. D’fhéadfadh go léireodh ionsú a thomhaistear sa raon seo láithreacht cáithníní nó boilgeoga aeir laistigh den sampla. Tá fiú cuvette smudged in ann léamh cúlra a mhealladh. Tugann fótaiméadair nua-aimseartha an rogha chun gné ceartúcháin cúlra a ghníomhachtú a chuirfidh i bhfeidhm aon ionsú cúlra ó gach luach tomhaiste eile a dhealú go huathoibríoch.
Ina theannta sin, féadfar speictream iomlán sampla aigéid núicléigh a ghabháil (go hiondúil idir 220 agus 320 nm). Trí chomparáidí a dhéanamh leis an speictream a fhaightear ó thuaslagán d’aigéad núicléach íon beifear in ann earráidí a d’fhéadfadh a bheith ann a bhrath le linn an phróisis tomhais chomh maith le láithreacht ábhar salaithe laistigh den sampla.
