This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English (English) 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (German) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
Pengukuran penyerapan larutan asid nukleik pada empat panjang gelombang sahaja adalah mencukupi untuk menentukan kepekatannya dan untuk mendapatkan gambaran tentang ketulenannya.
Sumber imej: DRogatnev/shutterstock.com
Asid nukleik diasingkan daripada bahan sampel seperti sel dan seterusnya digunakan dalam eksperimen makmal selanjutnya. Untuk tujuan ini, adalah dinasihatkan untuk menentukan kepekatan DNA atau RNA yang telah dimurnikan serta mengesahkan ketulenannya. Dengan cara ini, jumlah asid nukleik yang ditakrifkan dengan tepat akan memasuki aplikasi hiliran, dan sebarang pencemaran yang mungkin memberi kesan kepada tindak balas atau ujian sensitif dikesan dalam masa nyata.
Spektrofotometri UV-Vis ialah kaedah yang mudah, cepat dan teruji masa untuk mencapai objektif ini. Dalam julat 260 nm, asid nukleik menunjukkan puncak penyerapan ciri (rajah 1). Oleh itu nilai penyerapan ini digunakan untuk mengira kepekatan asid nukleik. Menurut undang-undang Lambert-Beer, dua parameter diperlukan untuk pengiraan kepekatan sampel: panjang laluan optik (= panjang laluan cahaya (L)) dan pekali kepupusan molar (material dan pemalar khusus panjang gelombang) bagi sampel yang hendak diukur. Faktor spesifik (F) boleh dikira apabila menggunakan kuvet piawai dengan laluan cahaya 1 cm. Faktor ini kemudiannya didarabkan dengan nilai penyerapan yang diukur (A) untuk mencapai kepekatan (C) larutan sampel. Pekali kepupusan molar dan faktor khusus, masing-masing, biasanya terdapat dalam kesusasteraan. Faktor untuk dsDNA, sebagai contoh, ialah 50 µg/mL (RNA: 40 µg/mL), dan ia mengikut takrifan bersamaan dengan satu unit penyerapan. data ini.
| Undang-undang Lambert-Beer: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (untuk laluan cahaya 1 cm) – C = A x F | C = Kepekatan A = Penyerapan L = Panjang laluan optik (cahaya). Ɛ = Pekali kepupusan molar (sampel dan khusus panjang gelombang) F = Faktor |
Untuk dapat membuat pernyataan tentang ketulenan sampel asid nukleik, penyerapan pada panjang gelombang selain daripada 260 nm perlu ditentukan (rajah 1). Hasil bagi yang diperoleh daripada nilai penyerapan yang diukur pada 260 nm, 280 nm dan 230 nm (A 260 /A 280 dan A 260 /A 230 ) membentuk nisbah ketulenan yang membantu mengenal pasti kemungkinan pencemaran. Kekotoran seperti protein dan kesan reagen yang digunakan semasa proses penulenan menghasilkan spektrum penyerapan yang berbeza daripada asid nukleik dan dengan itu mempengaruhi nisbah ketulenan (rajah 2). Nisbah A 260 /A 280 bagi larutan asid nukleik tulen adalah lebih kurang 1.8 – 2.0, manakala nisbah A 260 /A 230 biasanya akan menunjukkan nilai dalam julat 2.0 – 2.5.
Panjang gelombang keempat digunakan untuk menentukan latar belakang. Ia diukur pada atau melebihi 320 nm kerana asid nukleik atau bahan cemar organik tidak menyerap cahaya pada panjang gelombang ini. Serapan yang diukur dalam julat ini mungkin menunjukkan kehadiran zarah atau gelembung udara dalam sampel. Malah kuvet yang comot mampu menimbulkan bacaan latar belakang. Fotometer moden menawarkan pilihan untuk mengaktifkan ciri pembetulan latar belakang yang akan memberi kesan penolakan automatik bagi sebarang penyerapan latar belakang daripada semua nilai terukur yang lain.
Di samping itu, spektrum lengkap sampel asid nukleik boleh ditangkap (biasanya antara 220 dan 320 nm). Perbandingan dengan spektrum yang diperoleh daripada larutan asid nukleik tulen akan membolehkan pengesanan kemungkinan ralat semasa proses pengukuran serta kehadiran bahan cemar dalam sampel.
