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La medición de la absorbancia de una solución de ácido nucleico en solo cuatro longitudes de onda es suficiente para determinar su concentración y obtener una idea de su pureza.
Fuente de la imagen: DRogatnev/shutterstock.com
Los ácidos nucleicos se aíslan del material de muestra, como las células, y posteriormente se emplean en otros experimentos de laboratorio. Para ello, es recomendable determinar la concentración del ADN o ARN purificado así como verificar su pureza. De esta manera, cantidades definidas con precisión del ácido nucleico ingresarán a la aplicación posterior y cualquier contaminación que pueda afectar una reacción o ensayo sensible se detecta en tiempo real.
La espectrofotometría UV-Vis es un método fácil, rápido y probado para lograr estos objetivos. En el rango de 260 nm, los ácidos nucleicos muestran un pico de absorbancia característico (figura 1). Por lo tanto, este valor de absorbancia se usa para calcular las concentraciones de ácido nucleico. De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, se requieren dos parámetros para el cálculo de la concentración de una muestra: la longitud del camino óptico (= longitud del camino de la luz (L)) y el coeficiente de extinción molar (constante específica del material y de la longitud de onda) de la muestra a medir. El factor específico (F) se puede calcular utilizando una cubeta estándar con un paso de luz de 1 cm. Luego, este factor se multiplica por el valor de absorbancia medido (A) para llegar a la concentración (C) de la solución de muestra. Los coeficientes de extinción molar y los factores específicos, respectivamente, suelen estar disponibles en la literatura. El factor para dsDNA, por ejemplo, es 50 µg/mL (RNA: 40 µg/mL), y es por definición equivalente a una unidad de absorbancia. estos datos.
| Ley de Lambert-Beer: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (para un paso de luz de 1 cm) – C = A x F | C = Concentración A = Absorbancia L = Longitud del camino óptico (luz) Ɛ = Coeficiente de extinción molar (muestra y longitud de onda específica) F = Factor |
Para poder hacer una afirmación sobre la pureza de una muestra de ácido nucleico, se debe determinar la absorbancia a longitudes de onda distintas de 260 nm (figura 1). Los cocientes derivados de los valores de absorbancia medidos a 260 nm, 280 nm y 230 nm (A 260 /A 280 y A 260 /A 230 ) constituyen las relaciones de pureza que ayudan a identificar posibles contaminaciones. Las impurezas como proteínas y trazas de reactivos que se utilizaron durante el proceso de purificación producen un espectro de absorbancia diferente al de los ácidos nucleicos y, por lo tanto, influyen en las proporciones de pureza (figura 2). La relación A 260 /A 280 de soluciones de ácido nucleico puro será de aproximadamente 1,8 – 2,0, mientras que la relación A 260 /A 230 normalmente mostrará valores en el rango de 2,0 – 2,5.
Se utiliza una cuarta longitud de onda para determinar el fondo. Se mide a 320 nm o más, ya que ni los ácidos nucleicos ni los contaminantes orgánicos absorben la luz a esta longitud de onda. La absorbancia medida en este rango puede indicar la presencia de partículas o burbujas de aire dentro de la muestra. Incluso una cubeta manchada es capaz de obtener una lectura de fondo. Los fotómetros modernos ofrecen la opción de activar una función de corrección de fondo que efectuará la resta automática de cualquier absorbancia de fondo de todos los demás valores medidos.
Además, se puede capturar el espectro completo de una muestra de ácido nucleico (típicamente entre 220 y 320 nm). Las comparaciones con el espectro obtenido de una solución de ácido nucleico puro permitirán detectar posibles errores durante el proceso de medición, así como la presencia de contaminantes en la muestra.
