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Die Extinktionsmessung einer Nukleinsäurelösung bei nur vier Wellenlängen reicht aus, um ihre Konzentration zu bestimmen und einen Einblick in ihre Reinheit zu erhalten.
Bildquelle: DRogatnev/shutterstock.com
Nukleinsäuren werden aus Probenmaterial wie Zellen isoliert und anschließend in weiteren Laborexperimenten eingesetzt. Dazu empfiehlt es sich, die Konzentration der aufgereinigten DNA oder RNA zu bestimmen sowie deren Reinheit zu verifizieren. Auf diese Weise gelangen genau definierte Mengen der Nukleinsäure in die nachgelagerte Anwendung, und alle Verunreinigungen, die eine empfindliche Reaktion oder einen Assay beeinträchtigen könnten, werden in Echtzeit erkannt.
Die UV-Vis-Spektrophotometrie ist eine einfache, schnelle und bewährte Methode, um diese Ziele zu erreichen. Im Bereich von 260 nm zeigen Nukleinsäuren einen charakteristischen Extinktionspeak (Abbildung 1). Dieser Extinktionswert wird daher zur Berechnung der Nukleinsäurekonzentrationen verwendet. Nach dem Lambert-Beer-Gesetz werden zur Berechnung der Konzentration einer Probe zwei Parameter benötigt: die optische Weglänge (= Lichtweglänge (L)) und der molare Extinktionskoeffizient (material- und wellenlängenspezifische Konstante) der zu messende Probe. Der spezifische Faktor (F) kann bei Verwendung einer Standardküvette mit einem Lichtweg von 1 cm berechnet werden. Dieser Faktor wird dann mit dem gemessenen Extinktionswert (A) multipliziert, um die Konzentration (C) der Probenlösung zu erhalten. Molare Extinktionskoeffizienten bzw. spezifische Faktoren sind typischerweise in der Literatur verfügbar. Der Faktor für dsDNA beträgt beispielsweise 50 µg/mL (RNA: 40 µg/mL) und entspricht per Definition einer Extinktionseinheit. diese Daten.
| Lambert-Beer-Gesetz: C = A/(L x Ɛ) F = 1/Ɛ (für einen Lichtweg von 1 cm) – C = A x F | C = Konzentration A = Absorption L = optische (Licht-)Weglänge Ɛ = Molarer Extinktionskoeffizient (proben- und wellenlängenspezifisch) F = Faktor |
Um eine Aussage über die Reinheit einer Nukleinsäureprobe machen zu können, muss die Extinktion bei anderen Wellenlängen als 260 nm bestimmt werden (Abbildung 1). Die Quotienten aus den bei 260 nm, 280 nm und 230 nm gemessenen Extinktionswerten (A 260 /A 280 und A 260 /A 230 ) stellen die Reinheitsverhältnisse dar, die helfen, mögliche Verunreinigungen zu erkennen. Verunreinigungen wie Proteine und Spuren von Reagenzien, die während des Aufreinigungsprozesses verwendet wurden, ergeben ein anderes Absorptionsspektrum als Nukleinsäuren und beeinflussen somit die Reinheitsverhältnisse (Abbildung 2). Das A 260 /A 280 -Verhältnis von reinen Nukleinsäurelösungen beträgt ungefähr 1,8–2,0, während das Verhältnis A 260 /A 230 typischerweise Werte im Bereich von 2,0–2,5 aufweist.
Eine vierte Wellenlänge wird verwendet, um den Hintergrund zu bestimmen. Sie wird bei oder über 320 nm gemessen, da weder Nukleinsäuren noch organische Verunreinigungen Licht bei dieser Wellenlänge absorbieren. Die in diesem Bereich gemessene Extinktion kann auf das Vorhandensein von Partikeln oder Luftblasen in der Probe hinweisen. Selbst eine verschmutzte Küvette kann einen Hintergrundwert hervorrufen. Moderne Photometer bieten die Möglichkeit, eine Hintergrundkorrektur zu aktivieren, die eine automatische Subtraktion der Hintergrundabsorption von allen anderen Messwerten bewirkt.
Außerdem kann das vollständige Spektrum einer Nukleinsäureprobe erfasst werden (typischerweise zwischen 220 und 320 nm). Vergleiche mit dem Spektrum einer reinen Nukleinsäurelösung ermöglichen die Erkennung möglicher Fehler während des Messvorgangs sowie des Vorhandenseins von Verunreinigungen in der Probe.
