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Die Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen wird routinemäßig unter Verwendung von UV-Vis-Spektrophotometrie durchgeführt; Gelegentlich kann sich jedoch der Nachweis über Fluoreszenz als günstiger erweisen. In diesem Fall werden Moleküle nicht durch Extinktion nachgewiesen, sondern auf indirektem Weg – über das Signal eines Fluoreszenzfarbstoffs. Fluoreszenz bietet nicht nur eine hochempfindliche Nachweismethode, sondern ermöglicht auch die selektive Messung einzelner Analyten.

Fall 1: Wie gehe ich bei niedrig konzentrierten Probenlösungen vor?

Die UV-Vis-Spektrophotometrie ist nicht sehr empfindlich – um genaue und präzise Daten zu erhalten, sollten Probenkonzentrationen daher eine bestimmte Konzentrationsschwelle nicht unterschreiten. Für dsDNA liegt diese untere Grenze bei etwa 1 µg/ml. Auch wenn die untere Nachweisgrenze des Photometers noch nicht erreicht ist, ist der Einfluss der Messungenauigkeit in diesem Bereich erheblich und die resultierenden Werte können erheblichen Schwankungen unterliegen. Die fluorometrische Analyse, die 1000-mal empfindlicher ist als die Absorptionsmethode, ist in der Lage, Probenlösungen mit extrem niedrigen Konzentrationen sehr genau zu quantifizieren.

Fall 2: Wie kann ich trotz Probenkontamination eine genaue Quantifizierung durchführen?

Neben der Quantifizierung von Nukleinsäuren bei 260 nm bietet die UV-Vis-Spektrophotometrie die Möglichkeit, die Probenreinheit durch zusätzliche Wellenlängen (230 nm, 280 nm, 320 nm) bzw. einen Wellenlängenscan zu bestimmen. Die Datenanalyse erlaubt Rückschlüsse auf das Vorhandensein von Stoffen wie Salz, Proteinen oder Feststoffpartikeln. Wenn andererseits die Absorptionsspektren zu ähnlich sind, wie es bei den verschiedenen Nukleinsäuren der Fall ist, kann die Absorption allein nicht zwischen beispielsweise RNA und DNA unterscheiden. In diesem Fall ermöglichen Fluoreszenzmessungen die spezifische Quantifizierung von Analyten ohne Störung durch andere Moleküle.

Auf welchem Prinzip basiert diese Methode?

Fluoreszenzmessungen machen sich das Phänomen zunutze, dass bestimmte Moleküle Energie in Form von Licht abgeben können. Für den Nachweis von Biomolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen wird ein Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt, der mit möglichst hoher Spezifität an den Analyten bindet. Die Bindung des Reagenzes PicoGreen ® an dsDNA ist ein klassisches Beispiel. Nach Anregung des Komplexes mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (ca. 480 nm für PicoGreen) emittiert der Fluorophor Licht geringerer Energie, dh längerer Wellenlänge (ca. 520 nm für PicoGreen) (Abbildung 1). Das Licht wird als relative Fluoreszenz (RFU) gemessen, wobei die Intensität der Fluoreszenz proportional zur Konzentration der Probe ist.

Abbildung 1:
A) Prinzip der Fluoreszenzmessung von Nukleinsäuren (links)
B) Das zur Anregung des Fluorophors (EX) verwendete Licht hat eine kürzere Wellenlänge als das emittierte Licht (EM) (rechts)

Welche Materialien werden für diese Methode benötigt?

Die Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen profitiert von der Auswahl an Fluoreszenzfarbstoffen, die mit hoher Spezifität an ihr jeweiliges Zielmolekül binden. Außerdem muss mindestens ein Standard mit bekannter Konzentration verfügbar sein. Die Anregung des Fluorophors und die Messung der Fluoreszenzintensität des emittierten Lichts erfordern entweder ein eigenständiges Fluorometer oder ein Fluoreszenzmodul, das in ein anderes Instrument integriert ist. Ausrüstung und Fluoreszenzfarbstoff müssen kompatibel sein, damit die Lichtquelle im Gerät die erforderliche(n) Anregungswellenlänge(n) liefert und der Detektor das emittierte Licht misst. Je nach Gerätetyp befinden sich die Reagenzlösungen entweder in dünnwandigen Reaktionsgefäßen oder in Küvetten. Die Kompatibilität mit der spezifischen Anwendung hinsichtlich Passform, Transparenz, Autofluoreszenz und Volumen muss berücksichtigt werden.

Wie wird die Methode durchgeführt?

Abbildung 2 zeigt den Ablauf einer fluorometrischen Messung. Die Vorbereitung des Blindwerts, der Standards und der Probe wird durch die Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs eingeleitet, gefolgt von einer kurzen Inkubationszeit. Zuerst werden ein oder mehrere Standards bekannter Konzentrationen gemessen, um die Standardkurve zu erzeugen. Anschließend erfolgt in einem zweiten Schritt die Bestimmung der Probenkonzentration, bei der die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Proben in Relation zur Standardkurve ausgewertet werden.

Workflow-Fluoreszenz

Fluoreszenz – Methode der Wahl?

Auch wenn die Fluorometrie in bestimmten Fällen Vorteile bietet, ist die klassische UV-Vis-Spektrophotometrie nach wie vor die Standardmethode, wenn es um die Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen geht. Die Spektrophotometrie ermöglicht die Überprüfung der Probenreinheit, und hochkonzentrierte Lösungen können direkt analysiert werden. Abhängig von der Qualität der Probe sowie den Anforderungen nachgelagerter Anwendungen kann es sinnvoll sein, beide Techniken zu kombinieren.


PicoGreen® ist eine eingetragene Marke von Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , das Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® und Eppendorf µCuvette ® sind eingetragene Warenzeichen der Eppendorf AG, Deutschland. Alle Rechte vorbehalten, einschließlich Grafiken und Bilder. Copyright © 2019 Eppendorf AG.

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