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La quantification des acides nucléiques et des protéines est effectuée en routine à l’aide de la spectrophotométrie UV-Vis ; cependant, à l’occasion, la détection par fluorescence peut s’avérer plus favorable. Dans ce cas, les molécules ne sont pas détectées par absorbance, mais elles sont détectées de manière indirecte – via le signal d’un colorant fluorescent. Non seulement la fluorescence offre une méthode de détection très sensible, mais elle permet une mesure sélective des analytes individuels.
Cas 1 : Comment procéder avec des solutions d’échantillons à faible concentration ?
La spectrophotométrie UV-Vis n’est pas très sensible – afin d’obtenir des données exactes et précises, les concentrations des échantillons ne doivent donc pas descendre en dessous d’un certain seuil de concentration. Pour l’ADNdb, cette limite inférieure est d’environ 1 µg/mL. Même si la limite inférieure de détection du photomètre n’a pas été atteinte, l’impact de l’imprécision de mesure dans cette plage est considérable et les valeurs résultantes peuvent être sujettes à des variations substantielles. L’analyse fluorométrique, étant 1000 fois plus sensible que la méthode d’absorbance, est capable de quantifier très précisément des solutions d’échantillons de concentrations extrêmement faibles.
Cas 2 : Comment puis-je effectuer une quantification précise malgré la contamination de l’échantillon ?
En plus de la quantification des acides nucléiques à 260 nm, la spectrophotométrie UV-Vis offre la possibilité de déterminer la pureté de l’échantillon en utilisant des longueurs d’onde supplémentaires (230 nm, 280 nm, 320 nm) ou un balayage de longueur d’onde, respectivement. L’analyse des données permettra de tirer des conclusions sur la présence de substances telles que le sel, les protéines ou les particules solides. Si, au contraire, les spectres d’absorbance sont trop similaires, comme c’est le cas pour les différents acides nucléiques, l’absorbance seule ne pourra pas faire la distinction entre, par exemple, l’ARN et l’ADN. Dans ce cas, les mesures de fluorescence permettront la quantification spécifique des analytes, sans interférence d’autres molécules.
Sur quel principe repose cette méthode ?
Les mesures de fluorescence tirent parti du phénomène selon lequel certaines molécules sont capables d’émettre de l’énergie sous forme de lumière. Pour la détection de biomolécules telles que les acides nucléiques et les protéines, un colorant fluorescent est sélectionné qui se liera à l’analyte avec la plus grande spécificité possible. La liaison du réactif PicoGreen ® à l’ADNdb en est un exemple classique. Suite à l’excitation du complexe à l’aide d’une lumière d’une longueur d’onde spécifique (environ 480 nm pour PicoGreen), le fluorophore va émettre une lumière de moindre énergie, c’est-à-dire d’une longueur d’onde plus longue (environ 520 nm pour PicoGreen) (figure 1). La lumière est mesurée en fluorescence relative (RFU), où l’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration de l’échantillon.
A) Principe des mesures de fluorescence des acides nucléiques (à gauche)
B) La lumière qui est utilisée pour exciter le fluorophore (EX) a une longueur d’onde plus courte que la lumière émise (EM) (à droite)
Quels matériaux sont nécessaires pour cette méthode ?
La quantification des acides nucléiques et des protéines bénéficie de la sélection de colorants fluorescents qui se lient à leur molécule cible respective avec une grande spécificité. De plus, au moins un étalon de concentration connue doit être disponible. L’excitation du fluorophore et la mesure de l’intensité de fluorescence de la lumière émise nécessitent soit un fluoromètre autonome, soit un module de fluorescence intégré dans un autre instrument. L’équipement et le colorant fluorescent doivent être compatibles afin que la source lumineuse à l’intérieur de l’instrument fournisse la ou les longueurs d’onde d’excitation requises et que le détecteur mesure la lumière émise. Selon le type d’instrument, les solutions de réactifs se trouvent soit dans des récipients de réaction à parois minces, soit dans des cuvettes. La compatibilité avec l’application spécifique en ce qui concerne l’ajustement, la transparence, l’autofluorescence et le volume doit être prise en considération.
Comment se déroule la méthode ?
La figure 2 montre la séquence d’une mesure fluorimétrique. La préparation du blanc, des étalons et de l’échantillon est initiée par l’ajout du colorant fluorescent, suivi d’une courte période d’incubation. Tout d’abord, un ou plusieurs standards de concentrations connues sont mesurés afin de générer la courbe standard. La détermination de la concentration de l’échantillon a ensuite lieu dans une deuxième étape, où les intensités de fluorescence mesurées des échantillons sont évaluées par rapport à la courbe standard.
Fluorescence – méthode de choix ?
Même si la fluorimétrie présente des avantages dans certains cas, la spectrophotométrie UV-Vis classique reste la méthode standard en matière de quantification des acides nucléiques et des protéines. La spectrophotométrie permet de vérifier la pureté de l’échantillon et les solutions hautement concentrées peuvent être analysées directement. Selon la qualité de l’échantillon, ainsi que les exigences des applications en aval, il peut être conseillé de combiner les deux techniques.
PicoGreen® est une marque déposée de Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, États-Unis. Eppendorf ® , le design de marque Eppendorf, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® et Eppendorf µCuvette ® sont des marques déposées d’Eppendorf AG, Allemagne. Tous droits réservés, y compris les graphiques et les images. Copyright © 2019 Eppendorf AG.
