This post is also available in: English (Engels) Français (Frans) polski (Pools) Español (Spaans) Български (Bulgaars) Čeština (Tsjechisch) Esperanta (Esperanto) Eesti (Ests) Deutsch (Duits) Gaeilge (Iers) Italiano (Italiaans) 한국어 (Koreaans) Melayu (Malay) Norsk bokmål (Noors Bokmål) Português (Portugees, Portugal) Svenska (Zweeds)

Kwantificering van nucleïnezuren en eiwitten wordt routinematig uitgevoerd met behulp van UV-Vis-spectrofotometrie; soms kan detectie via fluorescentie echter gunstiger blijken te zijn. In dit geval worden moleculen niet gedetecteerd door absorptie, maar worden ze op een indirecte manier gedetecteerd – via het signaal van een fluorescerende kleurstof. Fluorescentie biedt niet alleen een zeer gevoelige detectiemethode, maar maakt ook selectieve meting van individuele analyten mogelijk.

Case 1: Hoe ga ik te werk met monsteroplossingen met een lage concentratie?

UV-Vis-spectrofotometrie is niet erg gevoelig – om nauwkeurige en nauwkeurige gegevens te verkrijgen, mogen monsterconcentraties daarom niet onder een bepaalde concentratiedrempel komen. Voor dsDNA is deze ondergrens ongeveer 1 µg/mL. Zelfs als de onderste detectielimiet van de fotometer niet is bereikt, is de impact van meetonnauwkeurigheid in dit bereik aanzienlijk, en resulterende waarden kunnen gevoelig zijn voor substantiële variaties. Fluorometrische analyse, die 1000 keer gevoeliger is dan de absorptiemethode, is in staat om monsteroplossingen van extreem lage concentraties zeer nauwkeurig te kwantificeren.

Case 2: Hoe kan ik een nauwkeurige kwantificering uitvoeren ondanks monsterverontreiniging?

Naast de kwantificering van nucleïnezuren bij 260 nm, biedt UV-Vis-spectrofotometrie de mogelijkheid om de zuiverheid van het monster te bepalen door gebruik te maken van respectievelijk extra golflengten (230 nm, 280 nm, 320 nm) of een golflengtescan. Door data-analyse kunnen conclusies worden getrokken over de aanwezigheid van stoffen zoals zout, eiwitten of vaste deeltjes. Als daarentegen de absorptiespectra te veel op elkaar lijken, zoals het geval is voor de verschillende nucleïnezuren, zal absorptie alleen niet in staat zijn om onderscheid te maken tussen bijvoorbeeld RNA en DNA. In dit geval zullen fluorescentiemetingen de specifieke kwantificering van analyten mogelijk maken, zonder interferentie van andere moleculen.

Op welk principe is deze methode gebaseerd?

Fluorescentiemetingen maken gebruik van het fenomeen dat bepaalde moleculen energie kunnen uitzenden in de vorm van licht. Voor de detectie van biomoleculen zoals nucleïnezuren en eiwitten wordt een fluorescerende kleurstof geselecteerd die zich met de hoogst mogelijke specificiteit aan de analyt zal binden. De binding van het reagens PicoGreen ® aan dsDNA is een klassiek voorbeeld. Na excitatie van het complex met licht van een specifieke golflengte (ongeveer 480 nm voor PicoGreen), zal de fluorofoor licht uitstralen met een lagere energie, dat wil zeggen van een langere golflengte (ongeveer 520 nm voor PicoGreen) (figuur 1). Het licht wordt gemeten als relatieve fluorescentie (RFU), waarbij de intensiteit van de fluorescentie evenredig is met de concentratie van het monster.

Figuur 1:
A) Principe van fluorescentiemetingen van nucleïnezuren (links)
B) Het licht dat wordt gebruikt om de fluorofoor (EX) te exciteren heeft een kortere golflengte dan het uitgezonden licht (EM) (rechts)

Welke materialen zijn nodig voor deze methode?

Kwantificering van nucleïnezuren en eiwitten profiteert van de selectie van fluorescerende kleurstoffen die met hoge specificiteit aan hun respectievelijke doelmolecuul binden. Bovendien moet er ten minste één standaard met bekende concentratie beschikbaar zijn. Voor excitatie van de fluorofoor en meting van de fluorescentie-intensiteit van het uitgestraalde licht is een op zichzelf staande fluorometer of een fluorescentiemodule nodig die in een ander instrument is geïntegreerd. Apparatuur en fluorescerende kleurstof moeten compatibel zijn, zodat de lichtbron in het instrument de vereiste excitatiegolflengte(n) levert en de detector het uitgestraalde licht meet. Afhankelijk van het type instrument bevinden de reagensoplossingen zich in dunwandige reactievaten of in cuvetten. Compatibiliteit met de specifieke toepassing met betrekking tot pasvorm, transparantie, autofluorescentie en volume moet in overweging worden genomen.

Hoe wordt de methode uitgevoerd?

Figuur 2 toont de volgorde van een fluorometrische meting. De voorbereiding van de blanco, de standaarden en het monster wordt gestart door de toevoeging van de fluorescerende kleurstof, gevolgd door een korte incubatieperiode. Eerst worden een of meer standaarden van bekende concentraties gemeten om de standaardcurve te genereren. Bepaling van de monsterconcentratie vindt vervolgens plaats in een tweede stap, waarbij de gemeten fluorescentie-intensiteiten van de monsters worden geëvalueerd in relatie tot de standaardcurve.

Workflow fluorescentie

Fluorescentie – methode naar keuze?

Ook al biedt fluorometrie in bepaalde gevallen voordelen, klassieke UV-Vis-spectrofotometrie blijft de standaardmethode als het gaat om kwantificering van nucleïnezuren en eiwitten. Met spectrofotometrie kan de zuiverheid van het monster worden gecontroleerd en kunnen sterk geconcentreerde oplossingen direct worden geanalyseerd. Afhankelijk van de kwaliteit van het monster en de vereisten van downstream-toepassingen, kan het raadzaam zijn om beide technieken te combineren.


PicoGreen ® is een geregistreerd handelsmerk van Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, VS. Eppendorf ® , het Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® en Eppendorf µCuvette ® zijn geregistreerde handelsmerken van Eppendorf AG, Duitsland. Alle rechten voorbehouden inclusief afbeeldingen en afbeeldingen. Copyright © 2019 Eppendorf AG.

Bron

Geef een reactie

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *