This post is also available in:
Nederlands (holenderski) 
English (angielski) 
Français (francuski) 
Español (hiszpański) 
Български (bułgarski) 
Čeština (czeski) 
Esperanta (esperanto) 
Eesti (estoński) 
Deutsch (niemiecki) 
Gaeilge (irlandzki) 
Italiano (włoski) 
한국어 (koreański) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (norweski bokmål) 
Português (portugalski, Portugalia) 
Svenska (szwedzki)
Kwantyfikacja kwasów nukleinowych i białek jest rutynowo przeprowadzana przy użyciu spektrofotometrii UV-Vis; jednak czasami wykrywanie za pomocą fluorescencji może okazać się bardziej korzystne. W tym przypadku cząsteczki nie są wykrywane przez absorbancję, ale są wykrywane w sposób pośredni – poprzez sygnał barwnika fluorescencyjnego. Fluorescencja nie tylko oferuje bardzo czułą metodę wykrywania, ale umożliwia selektywny pomiar poszczególnych analitów.
Przypadek 1: Jak postępować z roztworami próbek o niskim stężeniu?
Spektrofotometria UV-Vis nie jest bardzo czuła – w celu uzyskania dokładnych i precyzyjnych danych stężenia próbek nie powinny zatem spaść poniżej pewnego progu stężenia. Dla dsDNA ta dolna granica wynosi około 1 µg/ml. Nawet jeśli dolna granica wykrywalności fotometru nie została osiągnięta, wpływ niedokładności pomiaru w tym zakresie jest znaczny, a otrzymane wartości mogą być podatne na znaczne wahania. Analiza fluorometryczna, będąc 1000-krotnie bardziej czuła niż metoda absorbancji, umożliwia bardzo dokładne oznaczenie ilościowe roztworów próbek o bardzo niskich stężeniach.
Przypadek 2: Jak mogę przeprowadzić dokładną kwantyfikację pomimo zanieczyszczenia próbki?
Oprócz oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych przy 260 nm, spektrofotometria UV-Vis oferuje opcję określania czystości próbki poprzez zastosowanie dodatkowych długości fal (odpowiednio 230 nm, 280 nm, 320 nm) lub skanowania długości fal. Analiza danych pozwoli na wyciągnięcie wniosków dotyczących obecności substancji takich jak sól, białka czy cząstki stałe. Jeśli, z drugiej strony, widma absorbancji są zbyt podobne, jak w przypadku różnych kwasów nukleinowych, sama absorbancja nie będzie w stanie odróżnić na przykład RNA od DNA. W takim przypadku pomiary fluorescencji pozwolą na specyficzną kwantyfikację analitów bez ingerencji innych cząsteczek.
Na jakiej zasadzie opiera się ta metoda?
Pomiary fluorescencji wykorzystują zjawisko, że pewne cząsteczki są zdolne do emitowania energii w postaci światła. Do wykrywania biocząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe i białka, wybiera się barwnik fluorescencyjny, który będzie wiązał się z analitem z najwyższą możliwą specyficznością. Klasycznym przykładem jest wiązanie odczynnika PicoGreen ® z dsDNA. Po wzbudzeniu kompleksu światłem o określonej długości fali (około 480 nm dla PicoGreen), fluorofor będzie emitował światło o niższej energii, tj. o większej długości fali (około 520 nm dla PicoGreen) (rysunek 1). Światło jest mierzone jako fluorescencja względna (RFU), gdzie intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do stężenia próbki.
A) Zasada pomiaru fluorescencji kwasów nukleinowych (po lewej)
B) Światło wykorzystywane do wzbudzenia fluoroforu (EX) ma krótszą długość fali niż światło emitowane (EM) (po prawej)
Jakie materiały są wymagane do tej metody?
Ocena ilościowa kwasów nukleinowych i białek korzysta z wyboru barwników fluorescencyjnych, które wiążą się z odpowiednią cząsteczką docelową z wysoką specyficznością. Ponadto musi być dostępny co najmniej jeden wzorzec o znanym stężeniu. Wzbudzenie fluoroforu i pomiar intensywności fluorescencji emitowanego światła wymagają samodzielnego fluorometru lub modułu fluorescencyjnego zintegrowanego z innym przyrządem. Sprzęt i barwnik fluorescencyjny muszą być kompatybilne, aby źródło światła wewnątrz przyrządu zapewniało wymaganą długość fali wzbudzenia, a detektor mierzył emitowane światło. W zależności od typu aparatu roztwory odczynników są umieszczane w cienkościennych naczyniach reakcyjnych lub w kuwetach. Należy wziąć pod uwagę zgodność z konkretnym zastosowaniem pod względem dopasowania, przezroczystości, autofluorescencji i objętości.
Jak przebiega metoda?
Rysunek 2 przedstawia sekwencję pomiaru fluorymetrycznego. Przygotowanie ślepej próby, wzorców i próbki rozpoczyna się od dodania barwnika fluorescencyjnego, po czym następuje krótki okres inkubacji. Najpierw mierzy się jeden lub więcej standardów o znanych stężeniach w celu wygenerowania krzywej standardowej. Oznaczenie stężenia próbki następuje następnie w drugim etapie, w którym zmierzone natężenia fluorescencji próbek są oceniane w odniesieniu do krzywej standardowej.
Fluorescencja – metoda z wyboru?
Nawet jeśli fluorometria oferuje zalety w niektórych przypadkach, klasyczna spektrofotometria UV-Vis nadal jest standardową metodą, jeśli chodzi o ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych i białek. Spektrofotometria umożliwia weryfikację czystości próbki, a wysoko stężone roztwory mogą być analizowane bezpośrednio. W zależności od jakości próbki, a także wymagań dalszych aplikacji, może być wskazane połączenie obu technik.
PicoGreen® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Molecular Probes, Inc. Korporacja, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® i Eppendorf µCuvette ® są zastrzeżonymi znakami towarowymi Eppendorf AG, Niemcy. Wszelkie prawa zastrzeżone, w tym grafika i obrazy. Prawa autorskie © 2019 Eppendorf AG.
