This post is also available in: Nederlands (holenderski) English (angielski) Français (francuski) Español (hiszpański) Български (bułgarski) Čeština (czeski) Esperanta (esperanto) Eesti (estoński) Deutsch (niemiecki) Gaeilge (irlandzki) Italiano (włoski) 한국어 (koreański) Melayu (Malay) Norsk bokmål (norweski bokmål) Português (portugalski, Portugalia) Svenska (szwedzki)

Pomiar absorbancji roztworu kwasu nukleinowego przy zaledwie czterech długościach fali wystarcza do określenia jego stężenia i uzyskania wglądu w jego czystość.

Źródło obrazu: Drogatnev/shutterstock.com

Kwasy nukleinowe są izolowane z materiału próbki, takiego jak komórki, a następnie wykorzystywane w dalszych eksperymentach laboratoryjnych. W tym celu wskazane jest określenie stężenia oczyszczonego DNA lub RNA oraz weryfikacja ich czystości. W ten sposób dokładnie określone ilości kwasu nukleinowego wejdą do dalszych aplikacji, a wszelkie zanieczyszczenia, które mogą mieć wpływ na czułą reakcję lub oznaczenie, będą wykrywane w czasie rzeczywistym.

Spektrofotometria UV-Vis jest łatwą, szybką i sprawdzoną metodą pozwalającą na osiągnięcie tych celów. W zakresie 260 nm kwasy nukleinowe wykazują charakterystyczny pik absorbancji (rysunek 1). Ta wartość absorbancji jest zatem wykorzystywana do obliczania stężeń kwasów nukleinowych. Zgodnie z prawem Lamberta-Beera do obliczenia stężenia próbki wymagane są dwa parametry: długość drogi optycznej (= długość drogi świetlnej (L)) oraz molowy współczynnik ekstynkcji (stała właściwa dla materiału i długości fali) próbka do pomiaru. Konkretny współczynnik (F) można obliczyć przy użyciu standardowej kuwety o drodze światła 1 cm. Współczynnik ten jest następnie mnożony przez zmierzoną wartość absorbancji (A) w celu uzyskania stężenia (C) roztworu próbki. W literaturze zazwyczaj dostępne są odpowiednio molowe współczynniki ekstynkcji i specyficzne czynniki. Przykładowo współczynnik dsDNA wynosi 50 µg/ml (RNA: 40 µg/ml) i jest z definicji równoważny jednej jednostce absorbancji. te dane.

Prawo Lamberta-Beera:

C = A/(L x Ɛ )
F = 1/Ɛ (dla drogi światła 1 cm)

– C = A x F
C = stężenie
A = Absorbancja
L = Długość drogi optycznej (światła)
Ɛ = molowy współczynnik ekstynkcji
(w zależności od próbki i długości fali)
F = współczynnik
Rysunek 1: Widmo absorbancji kwasów nukleinowych przy odpowiednich długościach fal oraz przykład opisujący obliczenie stężenia próbki dsDNA.

Aby móc wydać oświadczenie o czystości próbki kwasu nukleinowego, należy określić absorbancję przy długości fali innej niż 260 nm (rysunek 1). Ilorazy pochodzące z wartości absorbancji mierzonej przy 260 nm, 280 nm i 230 nm (A 260 /A 280 i A 260 /A 230 ) stanowią współczynniki czystości, które pomagają zidentyfikować ewentualne zanieczyszczenia. Zanieczyszczenia, takie jak białka i ślady odczynników, które zostały użyte podczas procesu oczyszczania, dają inne widmo absorbancji niż kwasy nukleinowe, a tym samym wpływają na współczynniki czystości (rysunek 2). Stosunek A260 / A280 w czystych roztworach kwasu nukleinowego będzie wynosił około 1,8-2,0, podczas gdy stosunek A260 / A230 będzie zazwyczaj wykazywał wartości w zakresie 2,0-2,5.

Rysunek 2: Widma absorbancji kwasów nukleinowych i możliwych zanieczyszczeń

Do określenia tła wykorzystywana jest czwarta długość fali. Mierzy się ją przy długości fali 320 nm lub powyżej, ponieważ ani kwasy nukleinowe, ani zanieczyszczenia organiczne nie absorbują światła przy tej długości fali. Absorbancja mierzona w tym zakresie może wskazywać na obecność cząstek lub pęcherzyków powietrza w próbce. Nawet rozmazana kuweta jest w stanie wywołać odczyt w tle. Nowoczesne fotometry oferują opcję aktywacji funkcji korekcji tła, która spowoduje automatyczne odjęcie absorbancji tła od wszystkich innych wartości mierzonych.

Ponadto można wychwycić pełne widmo próbki kwasu nukleinowego (zwykle między 220 a 320 nm). Porównanie z widmem uzyskanym z czystego roztworu kwasu nukleinowego pozwoli na wykrycie ewentualnych błędów podczas procesu pomiarowego, a także obecność zanieczyszczeń w próbce.

Źródło