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La misurazione dell’assorbanza di una soluzione di acido nucleico a sole quattro lunghezze d’onda è sufficiente per determinarne la concentrazione e ottenere un’idea della sua purezza.
Fonte immagine: DRogatnev/shutterstock.com
Gli acidi nucleici vengono isolati dal materiale del campione come le cellule e successivamente impiegati in ulteriori esperimenti di laboratorio. A tale scopo, è consigliabile determinare la concentrazione del DNA o RNA purificato e verificarne la purezza. In questo modo, quantità accuratamente definite dell’acido nucleico entreranno nell’applicazione a valle e tutte le contaminazioni che potrebbero influire su una reazione o un’analisi sensibili vengono rilevate in tempo reale.
La spettrofotometria UV-Vis è un metodo facile, rapido e testato nel tempo per raggiungere questi obiettivi. Nell’intervallo di 260 nm, gli acidi nucleici mostrano un caratteristico picco di assorbimento (figura 1). Questo valore di assorbanza viene quindi utilizzato per calcolare le concentrazioni di acido nucleico. Secondo la legge di Lambert-Beer, per il calcolo della concentrazione di un campione sono richiesti due parametri: la lunghezza del cammino ottico (= lunghezza del cammino ottico (L)) e il coefficiente di estinzione molare (materiale e costante specifica della lunghezza d’onda) del campione da misurare. Il fattore specifico (F) può essere calcolato utilizzando una cuvetta standard con un percorso ottico di 1 cm. Questo fattore viene quindi moltiplicato per il valore di assorbanza misurato (A) per arrivare alla concentrazione (C) della soluzione campione. I coefficienti di estinzione molare e i fattori specifici, rispettivamente, sono tipicamente disponibili in letteratura. Il fattore per dsDNA, ad esempio, è 50 µg/mL (RNA: 40 µg/mL) ed è per definizione equivalente a un’unità di assorbanza. questi dati.
| Legge Lambert-Birra: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (per un percorso luminoso di 1 cm) – C = A x F | C = Concentrazione A = Assorbimento L = lunghezza del percorso ottico (luce). Ɛ = Coefficiente di estinzione molare (specifico del campione e della lunghezza d’onda) F = fattore |
Per poter fare una dichiarazione sulla purezza di un campione di acido nucleico, è necessario determinare l’assorbanza a lunghezze d’onda diverse da 260 nm (figura 1). I quozienti derivati dai valori di assorbanza misurati a 260 nm, 280 nm e 230 nm (A 260 /A 280 e A 260 /A 230 ) costituiscono i rapporti di purezza che aiutano a identificare possibili contaminazioni. Impurità come proteine e tracce di reagenti che sono state utilizzate durante il processo di purificazione producono uno spettro di assorbimento diverso da quello degli acidi nucleici e quindi influenzano i rapporti di purezza (figura 2). Il rapporto A 260 /A 280 delle soluzioni di acido nucleico puro sarà di circa 1,8 – 2,0, mentre il rapporto A 260 /A 230 mostrerà tipicamente valori nell’intervallo 2,0 – 2,5.
Una quarta lunghezza d’onda viene utilizzata per determinare lo sfondo. Viene misurato pari o superiore a 320 nm poiché né gli acidi nucleici né i contaminanti organici assorbono la luce a questa lunghezza d’onda. L’assorbanza misurata in questo intervallo può indicare la presenza di particelle o bolle d’aria all’interno del campione. Anche una cuvetta macchiata è in grado di suscitare una lettura di fondo. I fotometri moderni offrono la possibilità di attivare una funzione di correzione dello sfondo che effettuerà la sottrazione automatica di qualsiasi assorbanza dello sfondo da tutti gli altri valori misurati.
Inoltre, può essere catturato lo spettro completo di un campione di acido nucleico (tipicamente tra 220 e 320 nm). Il confronto con lo spettro ottenuto da una soluzione di acido nucleico puro consentirà di rilevare possibili errori durante il processo di misurazione nonché la presenza di contaminanti all’interno del campione.
