This post is also available in:
Nederlands (Nederlandsk) 
English (Engelsk) 
Français (Fransk) 
polski (Polsk) 
Español (Spansk) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (Tysk) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italiensk) 
한국어 (Koreanske) 
Melayu (Malay) 
Português (Portugisisk (Portugal)) 
Svenska (Swedish)
Absorbansmålingen av en nukleinsyreløsning ved bare fire bølgelengder er tilstrekkelig til å bestemme dens konsentrasjon og for å få innsikt i dens renhet.
Bildekilde: DRogatnev/shutterstock.com
Nukleinsyrer isoleres fra prøvemateriale som celler og brukes deretter i ytterligere laboratorieeksperimenter. For dette formålet er det tilrådelig å bestemme konsentrasjonen av renset DNA eller RNA samt verifisere deres renhet. På denne måten vil nøyaktig definerte mengder av nukleinsyren gå inn i nedstrømsapplikasjonen, og enhver forurensning som kan påvirke en sensitiv reaksjon eller analyse blir oppdaget i sanntid.
UV-Vis spektrofotometri er en enkel, rask og tidstestet metode for å nå disse målene. I området 260 nm viser nukleinsyrer en karakteristisk absorbanstopp (figur 1). Denne absorbansverdien brukes derfor til å beregne nukleinsyrekonsentrasjoner. I henhold til Lambert-Beer-loven kreves det to parametere for å beregne konsentrasjonen av en prøve: den optiske veilengden (= lysbanelengden (L)) og den molare ekstinksjonskoeffisienten (materiale- og bølgelengdespesifikk konstant) til prøve som skal måles. Den spesifikke faktoren (F) kan beregnes ved bruk av en standard kyvette med en lysbane på 1 cm. Denne faktoren multipliseres deretter med den målte absorbansverdien (A) for å komme frem til konsentrasjonen (C) av prøveløsningen. Molare ekstinksjonskoeffisienter og spesifikke faktorer er typisk tilgjengelig i litteraturen. Faktoren for dsDNA er for eksempel 50 µg/mL (RNA: 40 µg/ml), og det tilsvarer per definisjon én absorbansenhet. disse dataene.
| Lambert-Beer lov: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (for en lysbane på 1 cm) – C = A x F | C = Konsentrasjon A = Absorbans L = Optisk (lys) banelengde Ɛ = Molar ekstinksjonskoeffisient (prøve- og bølgelengdespesifikk) F = Faktor |
For å kunne uttale seg om renheten til en nukleinsyreprøve, må absorbansen ved andre bølgelengder enn 260 nm bestemmes (figur 1). Kvotene avledet fra absorbansverdiene målt ved 260 nm, 280 nm og 230 nm (A260/A280 og A260 /A230) utgjør renhetsforholdene som hjelper til med å identifisere mulige forurensninger. Urenheter som proteiner og spor av reagenser som ble brukt under renseprosessen gir et annet absorbansspektrum enn nukleinsyrene og påvirker dermed renhetsforholdene (figur 2). A 260 /A 280 -forholdet for rene nukleinsyreløsninger vil være omtrent 1,8 – 2,0, mens forholdet A 260 /A 230 typisk vil vise verdier i området 2,0 – 2,5.
En fjerde bølgelengde brukes til å bestemme bakgrunnen. Den måles ved eller over 320 nm da verken nukleinsyrer eller organiske forurensninger absorberer lys ved denne bølgelengden. Absorbans målt i dette området kan indikere tilstedeværelsen av partikler eller luftbobler i prøven. Selv en flekkete kyvette er i stand til å fremkalle en bakgrunnslesing. Moderne fotometre tilbyr muligheten til å aktivere en bakgrunnskorreksjonsfunksjon som vil bevirke automatisk subtraksjon av eventuell bakgrunnsabsorbans fra alle andre målte verdier.
I tillegg kan hele spekteret til en nukleinsyreprøve fanges opp (typisk mellom 220 og 320 nm). Sammenligninger med spekteret oppnådd fra en ren nukleinsyreløsning vil muliggjøre påvisning av mulige feil under måleprosessen samt tilstedeværelsen av forurensninger i prøven.
