This post is also available in:
Nederlands (Nederländska) 
English (Engelska) 
Français (Franska) 
polski (Polska) 
Español (Spanska) 
Български (Bulgariska) 
Čeština (Tjeckiska) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estniska) 
Deutsch (Tyska) 
Gaeilge (Irländska) 
Italiano (Italienska) 
한국어 (Koreanska) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norskt Bokmål) 
Português (Portugisiska, Portugal)
Absorbansmätningen av en nukleinsyralösning vid endast fyra våglängder är tillräcklig för att bestämma dess koncentration och för att få en inblick i dess renhet.
Bildkälla: DRogatnev/shutterstock.com
Nukleinsyror isoleras från provmaterial såsom celler och används därefter i ytterligare laboratorieexperiment. För detta ändamål är det tillrådligt att bestämma koncentrationen av det renade DNA eller RNA samt verifiera deras renhet. På detta sätt kommer noggrant definierade mängder av nukleinsyran in i nedströmsapplikationen, och alla föroreningar som kan påverka en känslig reaktion eller analys detekteras i realtid.
UV-Vis spektrofotometri är en enkel, snabb och beprövad metod för att uppnå dessa mål. Inom intervallet 260 nm visar nukleinsyror en karakteristisk absorbanstopp (figur 1). Detta absorbansvärde används därför för att beräkna nukleinsyrakoncentrationer. Enligt Lambert-Beer-lagen krävs två parametrar för beräkning av koncentrationen av ett prov: den optiska väglängden (= ljusvägslängden (L)) och den molära extinktionskoefficienten (material- och våglängdsspecifik konstant) för prov som ska mätas. Den specifika faktorn (F) kan beräknas vid användning av en standardkyvett med en ljusväg på 1 cm. Denna faktor multipliceras sedan med det uppmätta absorbansvärdet (A) för att komma fram till koncentrationen (C) av provlösningen. Molära extinktionskoefficienter respektive specifika faktorer är typiskt tillgängliga i litteraturen. Faktorn för dsDNA är till exempel 50 µg/mL (RNA: 40 µg/ml), och det motsvarar per definition en absorbansenhet. dessa uppgifter.
| Lambert-Beer lag: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (för en ljusbana på 1 cm) – C = A x F | C = Koncentration A = Absorbans L = Optisk (ljus) väglängd Ɛ = Molär extinktionskoefficient (prov och våglängdsspecifik) F = Faktor |
För att kunna göra ett uttalande om renheten hos ett nukleinsyraprov behöver absorbansen vid andra våglängder än 260 nm bestämmas (figur 1). Kvotienterna härledda från absorbansvärdena uppmätta vid 260 nm, 280 nm och 230 nm ( A260 / A280 och A260 / A230 ) utgör de renhetsförhållanden som hjälper till att identifiera möjliga föroreningar. Föroreningar som proteiner och spår av reagens som användes under reningsprocessen ger ett annat absorbansspektrum än nukleinsyror och påverkar därmed renhetsförhållandena (figur 2). A260 / A280 -förhållandet för rena nukleinsyralösningar kommer att vara ungefär 1,8 – 2,0, medan förhållandet A260 / A230 typiskt visar värden i intervallet 2,0 – 2,5.
En fjärde våglängd används för att bestämma bakgrunden. Den mäts vid eller över 320 nm eftersom varken nukleinsyror eller organiska föroreningar absorberar ljus vid denna våglängd. Absorbans mätt i detta intervall kan indikera närvaron av partiklar eller luftbubblor i provet. Även en utsmetad kyvett kan framkalla en bakgrundsavläsning. Moderna fotometrar erbjuder möjligheten att aktivera en bakgrundskorrigeringsfunktion som kommer att utföra automatisk subtraktion av eventuell bakgrundsabsorbans från alla andra uppmätta värden.
Dessutom kan det fullständiga spektrumet av ett nukleinsyraprov fångas (vanligtvis mellan 220 och 320 nm). Jämförelser med det spektrum som erhålls från en ren nukleinsyralösning kommer att möjliggöra detektering av möjliga fel under mätningsprocessen såväl som närvaron av föroreningar i provet.
