This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Deutsch (German) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
Nukleiinhappelahuse neeldumise mõõtmisest vaid neljal lainepikkusel piisab selle kontsentratsiooni määramiseks ja puhtuse kohta ülevaate saamiseks.
Pildi allikas: DRogatnev/shutterstock.com
Nukleiinhapped eraldatakse proovimaterjalist, näiteks rakkudest, ja seejärel kasutatakse neid edasistes laborikatsetes. Sel eesmärgil on soovitatav määrata puhastatud DNA või RNA kontsentratsioon ja kontrollida nende puhtust. Sel viisil sisenevad täpselt määratletud kogused nukleiinhapet allavoolu rakendusse ja kõik saasteained, mis võivad mõjutada tundlikku reaktsiooni või analüüsi, tuvastatakse reaalajas.
UV-Vis spektrofotomeetria on lihtne, kiire ja ajaproovitud meetod nende eesmärkide saavutamiseks. 260 nm vahemikus on nukleiinhapetel iseloomulik neeldumispiik (joonis 1). Seetõttu kasutatakse seda neeldumisväärtust nukleiinhapete kontsentratsioonide arvutamiseks. Lambert-Beeri seaduse järgi on proovi kontsentratsiooni arvutamiseks vaja kahte parameetrit: optilise tee pikkus (= valguse tee pikkus (L)) ja molaarne ekstinktsioonikoefitsient (materjali ja lainepikkuse spetsiifiline konstant). mõõdetav proov. Spetsiifilise teguri (F) saab arvutada, kui kasutatakse standardset küvetti, mille valgustee on 1 cm. Seejärel korrutatakse see tegur mõõdetud neeldumisväärtusega (A), et saada proovilahuse kontsentratsioon (C). Kirjanduses on tavaliselt saadaval vastavalt molaarsed ekstinktsioonikoefitsiendid ja spetsiifilised tegurid. Näiteks dsDNA tegur on 50 µg/ml (RNA: 40 µg/mL) ja see on definitsiooni järgi samaväärne ühe neeldumisühikuga. need andmed.
| Lambert-Beeri seadus: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (1 cm valgustee korral) – C = A x F | C = Kontsentratsioon A = neeldumine L = optilise (valguse) tee pikkus Ɛ = molaarne ekstinktsioonikoefitsient (proovi ja lainepikkusepõhine) F = tegur |
Nukleiinhappeproovi puhtuse kohta väite tegemiseks tuleb määrata neeldumine lainepikkustel, mis ei ole 260 nm (joonis 1). 260 nm, 280 nm ja 230 nm juures mõõdetud neeldumisväärtustest tuletatud jagatised (A 260 /A 280 ja A 260 /A 230 ) moodustavad puhtussuhted, mis aitavad tuvastada võimalikke saasteaineid. Puhastusprotsessis kasutatud lisandid, nagu valgud ja reaktiivide jäljed, annavad nukleiinhapete omast erineva neeldumisspektri ja mõjutavad seega puhtuse suhet (joonis 2). Puhaste nukleiinhappelahuste A260 / A280 suhe on ligikaudu 1,8–2,0, samas kui suhe A260 / A230 näitab tavaliselt väärtusi vahemikus 2,0–2,5.
Fooni määramiseks kasutatakse neljandat lainepikkust. Seda mõõdetakse 320 nm juures või kõrgemal, kuna ei nukleiinhapped ega orgaanilised saasteained ei neela sellel lainepikkusel valgust. Selles vahemikus mõõdetud neeldumine võib viidata osakeste või õhumullide olemasolule proovis. Isegi määrdunud küvett on võimeline esile kutsuma taustanäidu. Kaasaegsed fotomeetrid pakuvad võimalust aktiveerida taustakorrektsiooni funktsioon, mis lahutab automaatse tausta neeldumise kõigist muudest mõõdetud väärtustest.
Lisaks võib püüda kogu nukleiinhappeproovi spektrit (tavaliselt vahemikus 220–320 nm). Võrdlus puhta nukleiinhappelahusega saadud spektriga võimaldab tuvastada võimalikke vigu mõõtmisprotsessi ajal ja ka saasteainete olemasolu proovis.
