This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (German) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
La sorba mezurado de nuklea acida solvaĵo ĉe nur kvar ondolongoj sufiĉas por determini ĝian koncentriĝon kaj akiri sciojn pri ĝia pureco.
Bildfonto: DRogatnev/shutterstock.com
Nukleaj acidoj estas izolitaj de provaĵmaterialo kiel ekzemple ĉeloj kaj poste utiligitaj en pliaj laboratorioeksperimentoj. Por ĉi tiu celo, estas konsilinde determini la koncentriĝon de la purigita DNA aŭ RNA kaj kontroli ilian purecon. Tiamaniere, precize difinitaj kvantoj de la nuklea acido eniros la kontraŭfluan aplikaĵon, kaj ĉiuj poluadoj, kiuj povas influi senteman reagon aŭ analizon, estas detektitaj en reala tempo.
UV-Vis-spektrofotometrio estas facila, rapida kaj temp-testita metodo por atingi ĉi tiujn celojn. En la intervalo de 260 nm, nukleaj acidoj montras karakterizan absorbadpinton (figuro 1). Tiu absorbadvaloro estas tial uzita por kalkuli nukleajn acidajn koncentriĝojn. Laŭ la leĝo de Lambert-Beer, du parametroj estas bezonataj por la kalkulo de la koncentriĝo de specimeno: la optika padlongo (= lumvojlongo (L)) kaj la molara formortkoeficiento (materialo kaj ondolongo-specifa konstanto) de la specimeno mezurota. La specifa faktoro (F) povas esti kalkulita kiam oni uzas norman kuveton kun malpeza vojo de 1 cm. Tiu faktoro tiam estas multobligita per la mezurita absorbadvaloro (A) por alveni ĉe la koncentriĝo (C) de la provaĵsolvo. Molaj formortkoeficientoj kaj specifaj faktoroj, respektive, estas tipe haveblaj en la literaturo. La faktoro por dsDNA, ekzemple, estas 50 µg/mL (RNA: 40 µg/mL), kaj ĝi estas de difino ekvivalenta al unu sorba unuo. ĉi tiuj datumoj.
| Leĝo de Lambert-Beer: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (por malpeza vojo de 1 cm) – C = A x F | C = Koncentriĝo A = Sorbado L = Optika (luma) vojlongo Ɛ = Molara formortkoeficiento (specimeno kaj ondolong-specifa) F = Faktoro |
Por povi fari deklaron pri la pureco de nuklea acida provaĵo, la absorbo ĉe ondolongoj krom 260 nm devas esti determinita (figuro 1). La kvocientoj derivitaj de la absorbadvaloroj mezuritaj ĉe 260 nm, 280 nm kaj 230 nm (A 260 /A 280 kaj A 260 /A 230 ) konsistigas la purecoproporciojn kiuj helpas identigi eblajn poluojn. Malpuraĵoj kiel ekzemple proteinoj kaj spuroj de reakciiloj kiuj estis uzitaj dum la purigprocezo donas malsaman absorbadspektron de tiu de nukleaj acidoj kaj tiel influas la purecoproporciojn (figuro 2). La proporcio A 260 /A 280 de solvaĵoj de puraj nukleaj acidoj estos proksimume 1,8 – 2,0, dum la proporcio A 260 /A 230 tipe montros valorojn en la intervalo de 2,0 – 2,5.
Kvara ondolongo estas uzata por determini la fonon. Ĝi estas mezurita je aŭ super 320 Nm ĉar nek nukleaj acidoj nek organikaj poluaĵoj sorbas lumon ĉe tiu ondolongo. Sorbaco mezurita en ĉi tiu intervalo povas indiki la ĉeeston de partikloj aŭ aervezikoj ene de la provaĵo. Eĉ makulita kuveto kapablas ellogi fonan legadon. Modernaj fotomezuriloj ofertas la opcion de aktivigo de fonĝustigtrajto kiu efikos aŭtomatan subtraho de iu fonsorbado de ĉiuj aliaj mezurvaloroj.
Krome, la kompleta spektro de nuklea acida provaĵo povas esti kaptita (tipe inter 220 kaj 320 nm). Komparoj kun la spektro akirita de pura nuklea acida solvaĵo ebligos la detekton de eblaj eraroj dum la mezurprocezo same kiel la ĉeeston de poluaĵoj ene de la provaĵo.
