This post is also available in:
Nederlands (Holandský) 
English (Angličtina) 
Français (Francouzština) 
polski (Polský) 
Español (Španělský) 
Български (Bulharština) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonština) 
Deutsch (Němec) 
Gaeilge (Irský) 
Italiano (Ital) 
한국어 (Korejský) 
Melayu (Malajský) 
Norsk bokmål (Norwegian bokmål) 
Português (Portugalština ( Portugalsko)) 
Svenska (Švédský)
Měření absorbance roztoku nukleové kyseliny pouze při čtyřech vlnových délkách je dostatečné pro stanovení její koncentrace a pro získání náhledu na její čistotu.
Zdroj obrázků: DRogatnev/shutterstock.com
Nukleové kyseliny jsou izolovány ze vzorku materiálu, jako jsou buňky, a následně použity v dalších laboratorních experimentech. Pro tento účel je vhodné stanovit koncentraci purifikované DNA nebo RNA a také ověřit jejich čistotu. Tímto způsobem přesně definovaná množství nukleové kyseliny vstoupí do následné aplikace a jakékoli kontaminace, které mohou ovlivnit citlivou reakci nebo test, jsou detekovány v reálném čase.
UV-Vis spektrofotometrie je snadná, rychlá a časem prověřená metoda k dosažení těchto cílů. V rozsahu 260 nm vykazují nukleové kyseliny charakteristický pík absorbance (obrázek 1). Tato hodnota absorbance se proto používá k výpočtu koncentrací nukleové kyseliny. Podle Lambert-Beerova zákona jsou pro výpočet koncentrace vzorku nutné dva parametry: délka optické dráhy (= délka světelné dráhy (L)) a molární extinkční koeficient (konstanta specifická pro materiál a vlnovou délku) vzorku. vzorek k měření. Specifický faktor (F) lze vypočítat při použití standardní kyvety s dráhou světla 1 cm. Tento faktor se pak vynásobí naměřenou hodnotou absorbance (A), aby se dospělo ke koncentraci (C) roztoku vzorku. Molární extinkční koeficienty a specifické faktory jsou typicky dostupné v literatuře. Faktor pro dsDNA je například 50 ug/ml (RNA: 40 ug/ml) a je podle definice ekvivalentní jedné jednotce absorbance. tyto údaje.
| Lambert-Beerův zákon: C = A/(L x Ɛ) F = 1/Ɛ (pro dráhu světla 1 cm) – C = A x F | C = koncentrace A = Absorbance L = délka optické (světelné) dráhy Ɛ = Molární extinkční koeficient (specifické pro vzorek a vlnovou délku) F = faktor |
Aby bylo možné učinit prohlášení o čistotě vzorku nukleové kyseliny, je třeba určit absorbanci při vlnových délkách jiných než 260 nm (obrázek 1). Kvocienty odvozené z hodnot absorbance naměřených při 260 nm, 280 nm a 230 nm (A260/A280 a A260 /A230) tvoří poměry čistoty, které pomáhají identifikovat možné kontaminace. Nečistoty, jako jsou proteiny a stopy reagencií, které byly použity během procesu čištění, poskytují jiné absorbanční spektrum než spektrum nukleových kyselin a ovlivňují tak poměry čistoty (obrázek 2). Poměr A 260 /A 280 čistých roztoků nukleových kyselin bude přibližně 1,8 – 2,0, zatímco poměr A 260 /A 230 bude typicky vykazovat hodnoty v rozmezí 2,0 – 2,5.
K určení pozadí se používá čtvrtá vlnová délka. Měří se při nebo nad 320 nm, protože ani nukleové kyseliny ani organické kontaminanty neabsorbují světlo při této vlnové délce. Absorbance měřená v tomto rozsahu může indikovat přítomnost částic nebo vzduchových bublin ve vzorku. Dokonce i rozmazaná kyveta je schopna vyvolat čtení na pozadí. Moderní fotometry nabízejí možnost aktivace funkce korekce pozadí, která provede automatické odečtení jakékoli absorbance pozadí od všech ostatních naměřených hodnot.
Kromě toho může být zachyceno kompletní spektrum vzorku nukleové kyseliny (typicky mezi 220 a 320 nm). Srovnání se spektrem získaným z čistého roztoku nukleové kyseliny umožní detekci možných chyb během procesu měření a také přítomnost kontaminantů ve vzorku.
