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핵산 및 단백질의 정량화는 UV-Vis 분광광도법을 사용하여 일상적으로 수행됩니다. 그러나 경우에 따라 형광을 통한 검출이 더 유리한 것으로 판명될 수 있습니다. 이 경우 분자는 흡광도를 통해 감지되지 않지만 형광 염료의 신호를 통해 간접적인 방식으로 감지됩니다. 형광은 매우 민감한 검출 방법을 제공할 뿐만 아니라 개별 분석 물질을 선택적으로 측정할 수 있습니다.
사례 1: 저농도 시료 용액은 어떻게 진행합니까?
UV-Vis 분광광도법은 매우 민감하지 않습니다. 정확하고 정확한 데이터를 얻으려면 샘플 농도가 특정 농도 임계값 아래로 떨어지지 않도록 해야 합니다. dsDNA의 경우 이 하한은 약 1µg/mL입니다. 광도계의 감지 하한에 도달하지 않은 경우에도 이 범위에서 측정 부정확도의 영향이 크며 결과 값이 크게 변할 수 있습니다. 흡광도 방법보다 1000배 더 민감한 형광 분석은 극도로 낮은 농도의 시료 용액을 매우 정확하게 정량화할 수 있습니다.
사례 2: 샘플 오염에도 불구하고 어떻게 정확한 정량을 수행할 수 있습니까?
260 nm에서 핵산의 정량화 외에도 UV-Vis 분광 광도계는 각각 추가 파장(230 nm, 280 nm, 320 nm) 또는 파장 스캔을 사용하여 샘플 순도를 결정하는 옵션을 제공합니다. 데이터 분석을 통해 염분, 단백질 또는 고체 입자와 같은 물질의 존재에 관한 결론을 내릴 수 있습니다. 반면에 다른 핵산의 경우처럼 흡광도 스펙트럼이 너무 유사한 경우 흡광도만으로는 예를 들어 RNA와 DNA를 구별할 수 없습니다. 이 경우 형광 측정은 다른 분자의 간섭 없이 분석물의 특정 정량화를 허용합니다.
이 방법은 어떤 원칙을 기반으로 합니까?
형광 측정은 특정 분자가 빛의 형태로 에너지를 방출할 수 있다는 현상을 이용합니다. 핵산 및 단백질과 같은 생체 분자의 검출을 위해 가능한 가장 높은 특이도로 분석물에 결합하는 형광 염료가 선택됩니다. 시약 PicoGreen ® 과 dsDNA의 결합은 전형적인 예입니다. 특정 파장(PicoGreen의 경우 약 480nm)의 빛을 사용하여 복합체를 여기하면 형광단은 더 낮은 에너지, 즉 더 긴 파장(PicoGreen의 경우 약 520nm)의 빛을 방출합니다(그림 1). 빛은 상대 형광(RFU)으로 측정되며, 여기서 형광의 강도는 샘플의 농도에 비례합니다.
가) 핵산의 형광 측정 원리(좌)
B) 형광단을 여기시키는 데 사용되는 빛(EX)은 방출된 빛(EM)보다 파장이 짧습니다(오른쪽).
이 방법에는 어떤 재료가 필요합니까?
핵산 및 단백질의 정량화는 높은 특이도로 각각의 표적 분자에 결합하는 형광 염료를 선택하는 이점이 있습니다. 또한 알려진 농도의 표준이 하나 이상 있어야 합니다. 형광단의 여기와 방출된 빛의 형광 강도 측정에는 독립형 형광계 또는 다른 기기에 통합된 형광 모듈이 필요합니다. 장비 내부의 광원이 필요한 여기 파장을 제공하고 검출기가 방출된 빛을 측정할 수 있도록 장비와 형광 염료가 호환되어야 합니다. 기기 유형에 따라 시약 용액은 벽이 얇은 반응 용기 또는 큐벳에 있습니다. 적합성, 투명도, 자동 형광성 및 부피와 관련하여 특정 응용 프로그램과의 호환성을 고려해야 합니다.
방법은 어떻게 수행됩니까?
그림 2는 형광 측정의 순서를 보여줍니다. 블랭크, 표준 및 샘플의 준비는 형광 염료를 첨가한 후 짧은 배양 기간으로 시작됩니다. 먼저, 표준 곡선을 생성하기 위해 알려진 농도의 하나 이상의 표준이 측정됩니다. 샘플 농도의 결정은 두 번째 단계에서 이루어지며, 여기서 샘플의 측정된 형광 강도는 표준 곡선과 관련하여 평가됩니다.
형광 – 선택 방법?
특정 경우에 형광분석법이 이점을 제공하더라도 고전적인 UV-Vis 분광광도법은 핵산 및 단백질의 정량화와 관련하여 계속해서 표준 방법입니다. 분광광도법을 통해 시료 순도를 확인할 수 있으며 고농축 용액을 직접 분석할 수 있습니다. 샘플의 품질과 다운스트림 애플리케이션의 요구 사항에 따라 두 기술을 결합하는 것이 좋습니다.
PicoGreen ® 은 Molecular Probes, Inc.의 등록 상표입니다. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® 및 Eppendorf µCuvette ® 는 독일 Eppendorf AG의 등록 상표입니다. 그래픽 및 이미지를 포함한 판권 소유. 저작권 © 2019 Eppendorf AG.
