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La cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas se realiza de forma rutinaria mediante espectrofotometría UV-Vis; sin embargo, en ocasiones, la detección por fluorescencia puede resultar más favorable. En este caso, las moléculas no se detectan a través de la absorbancia, sino que se detectan de forma indirecta, a través de la señal de un tinte fluorescente. La fluorescencia no solo ofrece un método de detección altamente sensible, sino que también permite la medición selectiva de analitos individuales.
Caso 1: ¿Cómo procedo con soluciones de muestra de baja concentración?
La espectrofotometría UV-Vis no es muy sensible: para obtener datos exactos y precisos, no se debe permitir que las concentraciones de la muestra caigan por debajo de un cierto umbral de concentración. Para dsDNA, este límite inferior es de aproximadamente 1 µg/mL. Incluso si no se ha alcanzado el límite inferior de detección del fotómetro, el impacto de la imprecisión de la medición en este rango es considerable y los valores resultantes pueden ser propensos a variaciones sustanciales. El análisis fluorométrico, al ser 1000 veces más sensible que el método de absorbancia, es capaz de cuantificar soluciones de muestra de concentraciones extremadamente bajas con mucha precisión.
Caso 2: ¿Cómo puedo realizar una cuantificación precisa a pesar de la contaminación de la muestra?
Además de la cuantificación de ácidos nucleicos a 260 nm, la espectrofotometría UV-Vis ofrece la opción de determinar la pureza de la muestra empleando longitudes de onda adicionales (230 nm, 280 nm, 320 nm) o un escaneo de longitud de onda, respectivamente. El análisis de datos permitirá sacar conclusiones sobre la presencia de sustancias como sal, proteínas o partículas sólidas. Si, por el contrario, los espectros de absorbancia son demasiado similares, como es el caso de los diferentes ácidos nucleicos, la absorbancia por sí sola no podrá distinguir entre, por ejemplo, ARN y ADN. En este caso, las medidas de fluorescencia permitirán la cuantificación específica de analitos, sin interferencia de otras moléculas.
¿En qué principio se basa este método?
Las mediciones de fluorescencia aprovechan el fenómeno de que ciertas moléculas son capaces de emitir energía en forma de luz. Para la detección de biomoléculas como ácidos nucleicos y proteínas, se selecciona un colorante fluorescente que se unirá al analito con la mayor especificidad posible. La unión del reactivo PicoGreen ® a dsDNA es un ejemplo clásico. Tras la excitación del complejo utilizando luz de una longitud de onda específica (aproximadamente 480 nm para PicoGreen), el fluoróforo emitirá luz de menor energía, es decir, de una longitud de onda más larga (aproximadamente 520 nm para PicoGreen) (figura 1). La luz se mide como fluorescencia relativa (RFU), donde la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentración de la muestra.
A) Principio de las mediciones de fluorescencia de ácidos nucleicos (izquierda)
B) La luz que se utiliza para excitar el fluoróforo (EX) tiene una longitud de onda más corta que la luz emitida (EM) (derecha)
¿Qué materiales se requieren para este método?
La cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas se beneficia de la selección de tintes fluorescentes que se unen a su respectiva molécula diana con alta especificidad. Además, debe estar disponible al menos un estándar de concentración conocida. La excitación del fluoróforo y la medición de la intensidad de fluorescencia de la luz emitida requieren un fluorómetro independiente o un módulo de fluorescencia integrado en otro instrumento. El equipo y el tinte fluorescente deben ser compatibles para que la fuente de luz dentro del instrumento proporcione las longitudes de onda de excitación requeridas y el detector mida la luz emitida. Según el tipo de instrumento, las soluciones de reactivos se encuentran en recipientes de reacción de pared delgada o en cubetas. Debe tenerse en cuenta la compatibilidad con la aplicación específica con respecto al ajuste, la transparencia, la autofluorescencia y el volumen.
¿Cómo se lleva a cabo el método?
La Figura 2 muestra la secuencia de una medición fluorométrica. La preparación del blanco, los estándares y la muestra se inicia con la adición del colorante fluorescente, seguida de un breve período de incubación. Primero, se miden uno o más estándares de concentraciones conocidas para generar la curva estándar. Posteriormente, la determinación de la concentración de la muestra se lleva a cabo en un segundo paso, donde las intensidades de fluorescencia medidas de las muestras se evalúan en relación con la curva estándar.
Fluorescencia: ¿método de elección?
Aunque la fluorometría ofrece ventajas en determinados casos, la espectrofotometría UV-Vis clásica sigue siendo el método estándar en lo que respecta a la cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas. La espectrofotometría permite la verificación de la pureza de la muestra y las soluciones altamente concentradas se pueden analizar directamente. Dependiendo de la calidad de la muestra, así como de los requisitos de las aplicaciones posteriores, puede ser recomendable combinar ambas técnicas.
PicoGreen® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, EE. UU. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® y Eppendorf µCuvette ® son marcas registradas de Eppendorf AG, Alemania. Todos los derechos reservados incluyendo gráficos e imágenes. Copyright © 2019 Eppendorf AG.
