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A quantificação de ácidos e proteínas nucleicos é realizada rotineiramente utilizando espectrofotometria UV-Vis; no entanto, ocasionalmente, a deteção por fluorescência pode revelar-se mais favorável. Neste caso, as moléculas não são detetadas através da absorvância, mas são detetadas de forma indireta – através do sinal de um corante fluorescente. Não só a fluorescência oferece um método de deteção altamente sensível, como permite a medição seletiva de análises individuais.
Caso 1: Como proceder com soluções de amostra de baixa concentração?
A espectrofotometria UV-Vis não é muito sensível – para obter dados precisos e precisos, as concentrações de amostras não devem, portanto, ser permitidas abaixo de um determinado limiar de concentração. Para o dsDNA, este limite inferior é de aproximadamente 1 μg/mL. Mesmo que o limite inferior de deteção do fotometro não tenha sido atingido, o impacto da imprecisão de medição nesta gama é considerável, e os valores resultantes podem ser propensos a uma variação substancial. A análise fluorométrica, sendo 1000 vezes mais sensível do que o método de absorvância, é capaz de quantificar soluções de amostra de concentrações extremamente baixas com muito precisão.
Caso 2: Como posso realizar uma quantificação precisa apesar da contaminação da amostra?
Para além da quantificação dos ácidos nucleicos a 260 nm, a espectrofotometria UV-Vis oferece a opção de determinar a pureza da amostra utilizando comprimentos de onda adicionais (230 nm, 280 nm, 320 nm), ou um scan de comprimento de onda, respectivamente. A análise de dados permitirá conclusões sobre a presença de substâncias como sal, proteínas ou partículas sólidas. Se, por outro lado, os espectros de absorvância forem demasiado semelhantes, como é o caso dos diferentes ácidos nucleicos, a absorvância por si só não será capaz de distinguir entre, por exemplo, ORN e o ADN. Neste caso, as medições de fluorescência permitirão a quantificação específica de analíticas, sem interferência de outras moléculas.
Em que princípio se baseia este método?
As medições de fluorescência aproveitam o fenómeno que certas moléculas são capazes de emitir energia sob a forma de luz. Para a deteção de biomoléculas tais como ácidos nucleicos e proteínas, é selecionado um corante fluorescente que se ligará à substância com a maior especificidade possível. A ligação do reagente PicoGreen® ao DSDNA é um exemplo clássico. Após a excitação do complexo utilizando a luz de um comprimento de onda específico (aproximadamente 480 nm para picoGreen), o fluoróforo emitirá luz de menor energia, ou seja, de um comprimento de onda mais longo (aproximadamente 520 nm para PicoGreen) (figura 1). A luz é medida como fluorescência relativa (RFU), onde a intensidade da fluorescência é proporcional à concentração da amostra.
A) Princípio das medições de fluorescência dos ácidos nucleicos (à esquerda)
B) A luz utilizada para excitar o fluorophore (EX) tem um comprimento de onda mais curto do que a luz emitida (EM) (à direita)
Que materiais são necessários para este método?
A quantificação de ácidos nucleicos e proteínas beneficia da seleção de corantes fluorescentes que se ligam à respetiva molécula-alvo com alta especificidade. Além disso, deve estar disponível pelo menos um padrão de concentração conhecida. A excitação do fluorophore e a medição da intensidade da fluorescência da luz emitida requerem um fluorómetro autónomo ou um módulo de fluorescência que está integrado dentro de outro instrumento. O equipamento e o corante fluorescente devem ser compatíveis de modo a que a fonte luminosa no interior do instrumento forneça os comprimentos de onda de excitação necessários e o detetor mede a luz emitida. Dependendo do tipo de instrumento, as soluções de reagente estão localizadas em recipientes de reação de parede fina ou em cuvettes. Deve ser tida em conta a compatibilidade com a aplicação específica no que respeita à adaptação, à transparência, à auto-fluorescência e ao volume.
Como é executado o método?
A figura 2 mostra a sequência de uma medição fluorométrica. A preparação do espaço em branco, as normas e a amostra são iniciadas pela adição do corante fluorescente, seguida de um curto período de incubação. Em primeiro lugar, medem-se um ou mais padrões de concentrações conhecidas para gerar a curva padrão. Posteriormente, a determinação da concentração da amostra ocorre num segundo passo, em que as intensidades de fluorescência medida das amostras são avaliadas em relação à curva-padrão.
Fluorescência – método de escolha?
Mesmo que a fluorometria ofereça vantagens em certos casos, a espectrofotometria clássica UV-Vis continua a ser o método padrão quando se trata de quantificação de ácidos e proteínas nucleicos. A espectrofotometria permite a verificação da pureza da amostra, e as soluções altamente concentradas podem ser analisadas diretamente. Dependendo da qualidade da amostra, bem como dos requisitos das aplicações a jusante, pode ser aconselhável combinar ambas as técnicas.
PicoGreen® é uma marca registada da Molecular Probes, Inc. Corporação, Eugene, OU, EUA. Eppendorf®, Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer®, Uvette® e Eppendorf μCuvette® são marcas comerciais registadas da Eppendorf AG, Alemanha. Todos os direitos reservados, incluindo gráficos e imagens. Copyright © 2019 Eppendorf AG.
