This post is also available in:
Nederlands (Nederlandsk) 
English (Engelsk) 
Français (Fransk) 
polski (Polsk) 
Español (Spansk) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (Tysk) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italiensk) 
한국어 (Koreanske) 
Melayu (Malay) 
Português (Portugisisk (Portugal)) 
Svenska (Swedish)
Kvantifisering av nukleinsyrer og proteiner utføres rutinemessig ved bruk av UV-Vis spektrofotometri; Imidlertid kan påvisning via fluorescens av og til vise seg å være mer fordelaktig. I dette tilfellet oppdages ikke molekyler gjennom absorbans, men de oppdages på en indirekte måte – via signalet til et fluorescerende fargestoff. Ikke bare tilbyr fluorescens en svært sensitiv deteksjonsmetode, men den tillater selektiv måling av individuelle analytter.
Tilfelle 1: Hvordan går jeg frem med lavkonsentrasjonsprøveløsninger?
UV-Vis spektrofotometri er lite sensitiv – for å få nøyaktige og presise data bør prøvekonsentrasjoner derfor ikke tillates å falle under en viss konsentrasjonsterskel. For dsDNA er denne nedre grensen omtrent 1 µg/ml. Selv om den nedre grensen for deteksjon av fotometeret ikke er nådd, er virkningen av målingsunøyaktighet i dette området betydelig, og resulterende verdier kan være utsatt for betydelig variasjon. Fluorometrisk analyse, som er 1000 ganger mer følsom enn absorbansmetoden, er i stand til å kvantifisere prøveløsninger med ekstremt lave konsentrasjoner svært nøyaktig.
Tilfelle 2: Hvordan kan jeg utføre nøyaktig kvantifisering til tross for prøvekontaminering?
I tillegg til kvantifisering av nukleinsyrer ved 260 nm, tilbyr UV-Vis spektrofotometri muligheten for å bestemme prøverenheten ved å bruke ytterligere bølgelengder (henholdsvis 230 nm, 280 nm, 320 nm), eller en bølgelengdeskanning. Dataanalyse vil tillate konklusjoner angående tilstedeværelsen av stoffer som salt, proteiner eller faste partikler. Dersom absorbansspektrene derimot er for like, slik tilfellet er for de ulike nukleinsyrene, vil ikke absorbansen alene kunne skille mellom for eksempel RNA og DNA. I dette tilfellet vil fluorescensmålinger tillate spesifikk kvantifisering av analytter, uten interferens fra andre molekyler.
Hvilket prinsipp er denne metoden basert på?
Fluorescensmålinger drar nytte av fenomenet at visse molekyler er i stand til å sende ut energi i form av lys. For påvisning av biomolekyler som nukleinsyrer og proteiner velges et fluorescerende fargestoff som vil binde seg til analytten med høyest mulig spesifisitet. Bindingen av reagenset PicoGreen ® til dsDNA er et klassisk eksempel. Etter eksitering av komplekset ved bruk av lys med en spesifikk bølgelengde (ca. 480 nm for PicoGreen), vil fluoroforen sende ut lys med lavere energi, dvs. med lengre bølgelengde (ca. 520 nm for PicoGreen) (figur 1). Lyset måles som relativ fluorescens (RFU), hvor intensiteten av fluorescensen er proporsjonal med konsentrasjonen av prøven.
A) Prinsipp for fluorescensmålinger av nukleinsyrer (til venstre)
B) Lyset som brukes til å eksitere fluoroforen (EX) har en kortere bølgelengde enn det utsendte lyset (EM) (høyre)
Hvilke materialer kreves for denne metoden?
Kvantifisering av nukleinsyrer og proteiner drar nytte av utvalget av fluorescerende fargestoffer som binder seg til deres respektive målmolekyler med høy spesifisitet. I tillegg må minst én standard med kjent konsentrasjon være tilgjengelig. Eksitering av fluoroforen og måling av fluorescensintensiteten til det utsendte lyset krever enten et frittstående fluorometer eller en fluorescensmodul som er integrert i et annet instrument. Utstyr og fluorescerende fargestoff må være kompatible slik at lyskilden inne i instrumentet gir den nødvendige eksitasjonsbølgelengden(e) og detektoren måler lyset som sendes ut. Avhengig av type instrument er reagensløsningene plassert enten i tynnveggede reaksjonsbeholdere eller i kyvetter. Kompatibilitet med den spesifikke applikasjonen med hensyn til passform, transparens, autofluorescens og volum må tas i betraktning.
Hvordan utføres metoden?
Figur 2 viser sekvensen av en fluorometrisk måling. Forberedelse av blindprøven, standardene og prøven initieres ved tilsetning av det fluorescerende fargestoffet, etterfulgt av en kort inkubasjonsperiode. Først måles en eller flere standarder med kjente konsentrasjoner for å generere standardkurven. Bestemmelse av prøvekonsentrasjon skjer deretter i et andre trinn, hvor de målte fluorescensintensitetene til prøvene vurderes i forhold til standardkurven.
Fluorescens – valgmetode?
Selv om fluorometri gir fordeler i visse tilfeller, fortsetter klassisk UV-Vis-spektrofotometri å være standardmetoden når det gjelder kvantifisering av nukleinsyrer og proteiner. Spektrofotometri tillater verifisering av prøverenhet, og høyt konsentrerte løsninger kan analyseres direkte. Avhengig av kvaliteten på prøven, samt kravene til nedstrømsapplikasjoner, kan det være lurt å kombinere begge teknikkene.
PicoGreen ® er et registrert varemerke for Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® og Eppendorf µCuvette ® er registrerte varemerker for Eppendorf AG, Tyskland. Alle rettigheter forbeholdt, inkludert grafikk og bilder. Copyright © 2019 Eppendorf AG.
