This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (German) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
Kuantifikasi asid nukleik dan protein secara rutin dilakukan menggunakan spektrofotometri UV-Vis; namun, kadangkala, pengesanan melalui pendarfluor mungkin terbukti lebih baik. Dalam kes ini, molekul tidak dikesan melalui penyerapan, tetapi ia dikesan secara tidak langsung – melalui isyarat pewarna pendarfluor. Pendarfluor bukan sahaja menawarkan kaedah pengesanan yang sangat sensitif, tetapi ia membenarkan pengukuran terpilih bagi analit individu.
Kes 1: Bagaimanakah saya meneruskan penyelesaian sampel berkepekatan rendah?
Spektrofotometri UV-Vis tidak begitu sensitif – untuk mendapatkan data yang tepat dan tepat, kepekatan sampel tidak seharusnya dibenarkan jatuh di bawah ambang kepekatan tertentu. Untuk dsDNA, had bawah ini adalah lebih kurang 1 µg/mL. Walaupun had bawah pengesanan fotometer belum dicapai, kesan ketidaktepatan pengukuran dalam julat ini adalah besar, dan nilai yang terhasil mungkin terdedah kepada variasi yang besar. Analisis fluorometrik, yang 1000 kali ganda lebih sensitif daripada kaedah penyerapan, mampu mengukur penyelesaian sampel dengan kepekatan yang sangat rendah dengan sangat tepat.
Kes 2: Bagaimanakah saya boleh melakukan kuantifikasi yang tepat walaupun sampel tercemar?
Sebagai tambahan kepada kuantifikasi asid nukleik pada 260 nm, spektrofotometri UV-Vis menawarkan pilihan untuk menentukan ketulenan sampel dengan menggunakan panjang gelombang tambahan (230 nm, 280 nm, 320 nm), atau imbasan panjang gelombang, masing-masing. Analisis data akan membolehkan kesimpulan mengenai kehadiran bahan seperti garam, protein, atau zarah pepejal. Jika, sebaliknya, spektrum penyerapan terlalu serupa, seperti yang berlaku untuk asid nukleik yang berbeza, penyerapan sahaja tidak akan dapat membezakan antara, sebagai contoh, RNA dan DNA. Dalam kes ini, ukuran pendarfluor akan membenarkan kuantifikasi khusus analit, tanpa gangguan daripada molekul lain.
Pada prinsip manakah kaedah ini berasaskan?
Pengukuran pendarfluor mengambil kesempatan daripada fenomena bahawa molekul tertentu mampu memancarkan tenaga dalam bentuk cahaya. Untuk pengesanan biomolekul seperti asid nukleik dan protein, pewarna pendarfluor dipilih yang akan mengikat analit dengan kekhususan yang paling tinggi. Pengikatan reagen PicoGreen ® kepada dsDNA adalah contoh klasik. Berikutan pengujaan kompleks menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (kira-kira 480 nm untuk PicoGreen), fluorophore akan memancarkan cahaya tenaga yang lebih rendah, iaitu panjang gelombang yang lebih panjang (kira-kira 520 nm untuk PicoGreen) (rajah 1). Cahaya diukur sebagai pendarfluor relatif (RFU), di mana keamatan pendarfluor adalah berkadar dengan kepekatan sampel.
A) Prinsip pengukuran pendarfluor asid nukleik (kiri)
B) Cahaya yang digunakan untuk mengujakan fluorophore (EX) mempunyai panjang gelombang yang lebih pendek daripada cahaya yang dipancarkan (EM) (kanan)
Bahan manakah yang diperlukan untuk kaedah ini?
Kuantifikasi asid nukleik dan protein mendapat manfaat daripada pemilihan pewarna pendarfluor yang mengikat molekul sasaran masing-masing dengan kekhususan yang tinggi. Di samping itu, sekurang-kurangnya satu piawai kepekatan yang diketahui mesti ada. Pengujaan fluorophore dan pengukuran keamatan pendarfluor cahaya yang dipancarkan memerlukan sama ada pendarfluor yang berdiri sendiri atau modul pendarfluor yang disepadukan dalam instrumen lain. Peralatan dan pewarna pendarfluor mestilah serasi supaya sumber cahaya di dalam instrumen memberikan panjang gelombang pengujaan yang diperlukan dan pengesan mengukur cahaya yang dipancarkan. Bergantung pada jenis instrumen, larutan reagen terletak sama ada dalam bekas tindak balas berdinding nipis atau dalam kuvet. Keserasian dengan aplikasi khusus berkenaan dengan kesesuaian, ketelusan, auto-pendarfluor dan volum mesti diambil kira.
Bagaimanakah kaedah dijalankan?
Rajah 2 menunjukkan jujukan ukuran fluorometrik. Penyediaan kosong, piawaian dan sampel dimulakan dengan penambahan pewarna pendarfluor, diikuti dengan tempoh pengeraman yang singkat. Pertama, satu atau lebih piawai kepekatan yang diketahui diukur untuk menghasilkan lengkung piawai. Penentuan kepekatan sampel kemudiannya berlaku dalam langkah kedua, di mana keamatan pendarfluor yang diukur sampel dinilai berhubung dengan lengkung piawai.
Pendarfluor – kaedah pilihan?
Walaupun fluorometri menawarkan kelebihan dalam kes-kes tertentu, spektrofotometri UV-Vis klasik terus menjadi kaedah standard apabila ia berkaitan dengan kuantifikasi asid nukleik dan protein. Spektrofotometri membolehkan pengesahan ketulenan sampel, dan penyelesaian yang sangat pekat boleh dianalisis secara langsung. Bergantung pada kualiti sampel, serta keperluan aplikasi hiliran, mungkin dinasihatkan untuk menggabungkan kedua-dua teknik.
PicoGreen ® ialah tanda dagangan berdaftar Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, ATAU, AS. Eppendorf ® , Reka Bentuk Jenama Eppendorf, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® dan Eppendorf µCuvette ® ialah tanda dagangan berdaftar Eppendorf AG, Jerman. Semua hak terpelihara termasuk grafik dan imej. Hak Cipta © 2019 Eppendorf AG.
