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La quantificazione degli acidi nucleici e delle proteine viene eseguita di routine utilizzando la spettrofotometria UV-Vis; tuttavia, a volte, il rilevamento tramite fluorescenza può rivelarsi più favorevole. In questo caso, le molecole non vengono rilevate attraverso l’assorbanza, ma vengono rilevate in modo indiretto, tramite il segnale di un colorante fluorescente. Non solo la fluorescenza offre un metodo di rilevamento altamente sensibile, ma consente la misurazione selettiva dei singoli analiti.
Caso 1: come si procede con soluzioni campione a bassa concentrazione?
La spettrofotometria UV-Vis non è molto sensibile: per ottenere dati accurati e precisi, le concentrazioni del campione non dovrebbero quindi essere lasciate scendere al di sotto di una certa soglia di concentrazione. Per il dsDNA, questo limite inferiore è di circa 1 µg/mL. Anche se il limite inferiore di rilevamento del fotometro non è stato raggiunto, l’impatto dell’imprecisione della misurazione in questo intervallo è considerevole e i valori risultanti possono essere soggetti a variazioni sostanziali. L’analisi fluorometrica, essendo 1000 volte più sensibile del metodo di assorbanza, è in grado di quantificare in modo molto accurato soluzioni campione di concentrazioni estremamente basse.
Caso 2: come posso eseguire una quantificazione accurata nonostante la contaminazione del campione?
Oltre alla quantificazione degli acidi nucleici a 260 nm, la spettrofotometria UV-Vis offre la possibilità di determinare la purezza del campione utilizzando lunghezze d’onda aggiuntive (230 nm, 280 nm, 320 nm) o una scansione della lunghezza d’onda, rispettivamente. L’analisi dei dati consentirà di trarre conclusioni sulla presenza di sostanze come sale, proteine o particelle solide. Se invece gli spettri di assorbanza sono troppo simili, come nel caso dei diversi acidi nucleici, l’assorbanza da sola non sarà in grado di distinguere, ad esempio, tra RNA e DNA. In questo caso, le misure di fluorescenza consentiranno la quantificazione specifica degli analiti, senza interferenze da parte di altre molecole.
Su quale principio si basa questo metodo?
Le misurazioni della fluorescenza sfruttano il fenomeno che alcune molecole sono in grado di emettere energia sotto forma di luce. Per il rilevamento di biomolecole come acidi nucleici e proteine, viene selezionato un colorante fluorescente che si legherà all’analita con la massima specificità possibile. Il legame del reagente PicoGreen ® al dsDNA è un classico esempio. Dopo l’eccitazione del complesso utilizzando luce di una lunghezza d’onda specifica (circa 480 nm per PicoGreen), il fluoroforo emetterà luce di energia inferiore, cioè di lunghezza d’onda maggiore (circa 520 nm per PicoGreen) (figura 1). La luce viene misurata come fluorescenza relativa (RFU), dove l’intensità della fluorescenza è proporzionale alla concentrazione del campione.
A) Principio delle misure di fluorescenza degli acidi nucleici (a sinistra)
B) La luce utilizzata per eccitare il fluoroforo (EX) ha una lunghezza d’onda più corta della luce emessa (EM) (a destra)
Quali materiali sono necessari per questo metodo?
La quantificazione degli acidi nucleici e delle proteine trae vantaggio dalla selezione di coloranti fluorescenti che si legano alla rispettiva molecola bersaglio con elevata specificità. Inoltre, deve essere disponibile almeno uno standard di concentrazione nota. L’eccitazione del fluoroforo e la misurazione dell’intensità di fluorescenza della luce emessa richiedono un fluorimetro autonomo o un modulo di fluorescenza integrato in un altro strumento. L’attrezzatura e il colorante fluorescente devono essere compatibili in modo che la sorgente luminosa all’interno dello strumento fornisca la/e lunghezza/e di eccitazione richiesta e il rivelatore misuri la luce emessa. A seconda del tipo di strumento, le soluzioni reagenti si trovano in recipienti di reazione a parete sottile o in cuvette. Deve essere presa in considerazione la compatibilità con l’applicazione specifica per quanto riguarda adattamento, trasparenza, autofluorescenza e volume.
Come viene eseguito il metodo?
La figura 2 mostra la sequenza di una misurazione fluorimetrica. La preparazione del bianco, degli standard e del campione viene avviata mediante l’aggiunta del colorante fluorescente, seguita da un breve periodo di incubazione. In primo luogo, vengono misurati uno o più standard di concentrazioni note per generare la curva standard. La determinazione della concentrazione del campione avviene successivamente in una seconda fase, in cui le intensità di fluorescenza misurate dei campioni vengono valutate in relazione alla curva standard.
Fluorescenza: metodo di scelta?
Anche se la fluorometria offre vantaggi in alcuni casi, la classica spettrofotometria UV-Vis continua a essere il metodo standard quando si tratta di quantificazione di acidi nucleici e proteine. La spettrofotometria consente la verifica della purezza del campione e le soluzioni altamente concentrate possono essere analizzate direttamente. A seconda della qualità del campione, nonché dei requisiti delle applicazioni a valle, può essere consigliabile combinare entrambe le tecniche.
PicoGreen ® è un marchio registrato di Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® e Eppendorf µCuvette ® sono marchi registrati di Eppendorf AG, Germania. Tutti i diritti riservati compresi grafica e immagini. Copyright © 2019 Eppendorf AG.
