This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (German) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
Déantar aigéid núicléacha agus próitéiní a chainníochtú go rialta trí úsáid a bhaint as speictreafótaiméadracht UV-Vis; uaireanta, áfach, d’fhéadfadh braite trí fhluaraiseacht a bheith níos fabhraí. Sa chás seo, ní aimsítear móilíní trí ionsúiteacht, ach braitear iad ar bhealach indíreach – trí chomhartha ruaime fluaraisigh. Ní hamháin go dtugann fluaraiseacht modh braite an-íogair, ach ceadaíonn sé anailítí aonair a thomhas go roghnach.
Cás 1: Conas a rachaidh mé ar aghaidh le réitigh samplacha íseal-tiúchana?
Níl an speictrophotiméadracht UV-Vis an-íogair – chun sonraí beachta agus beachta a fháil, níor cheart ligean do thiúchan na samplaí titim faoi thairseach tiúchana áirithe. Maidir le dsDNA, tá an teorainn íochtair seo thart ar 1 µg/mL. Fiú mura bhfuil an teorainn braite ar an bhfótaiméadar sroichte, tá tionchar an mhíchruinnis tomhais sa raon seo suntasach, agus d’fhéadfadh go mbeadh éagsúlacht shuntasach sna luachanna mar thoradh air. Tá anailís fhluairmhéadrach, atá 1000-huaire níos íogaire ná an modh ionsúcháin, in ann réitigh shamplacha de thiúchan an-íseal a chainníochtú go han-chruinn.
Cás 2: Conas is féidir liom cainníochtú cruinn a dhéanamh in ainneoin éillithe samplach?
Chomh maith le cainníochtú aigéid núicléacha ag 260 nm, cuireann speictrophotiméadracht UV-Vis an rogha chun íonacht samplach a chinneadh trí thonnfhad breise (230 nm, 280 nm, 320 nm), nó scanadh tonnfhad, faoi seach a úsáid. Ceadóidh anailís sonraí conclúidí maidir le láithreacht substaintí amhail salann, próitéiní, nó cáithníní soladacha. Más rud é, ar an láimh eile, go bhfuil na speictrim ionsúcháin ró-chosúil, mar atá i gcás na n-aigéid núicléacha éagsúla, ní bheidh ionsúiteacht amháin in ann idirdhealú a dhéanamh idir, mar shampla, RNA agus DNA. Sa chás seo, ceadóidh tomhais fhluaraiseachta anailítí a chainníochtú go sonrach, gan cur isteach ó mhóilíní eile.
Cén prionsabal ar a bhfuil an modh seo bunaithe?
Baineann tomhais fhluaraiseachta leas as an bhfeiniméan go bhfuil móilíní áirithe in ann fuinneamh a astú i bhfoirm solais. Chun bithmhóilíní amhail aigéid núicléasacha agus próitéiní a bhrath, roghnaítear dath fluaraiseacha a cheangail leis an anailít leis an sainiúlacht is airde is féidir. Is sampla clasaiceach é nascadh an imoibrí PicoGreen ® le dsDNA. Tar éis excitation an choimpléasc ag baint úsáide as solas de thonnfhad ar leith (thart ar 480 nm do PicoGreen), scaoilfidh an fluorophore solas le fuinneamh níos ísle, ie de thonnfhad níos faide (thart ar 520 nm do PicoGreen) (figiúr 1). Déantar an solas a thomhas mar fhluaraiseacht choibhneasta (RFU), áit a bhfuil déine an fhluaraiseachta comhréireach le tiúchan an tsampla.
A) Prionsabal tomhais fhluaraiseachta aigéid núicléacha (ar chlé)
B) Tá tonnfhad níos giorra ná an solas astaithe (EM) (ar dheis) ag an solas a úsáidtear chun an fluorophore (EX) a spreagadh
Cé na hábhair atá ag teastáil don mhodh seo?
Baineann cainníochtú aigéid núicléacha agus próitéiní leas as roghnú na ruaimeanna fluaraiseacha a cheanglaíonn a sprioc-mhóilín faoi seach le sainiúlacht ard. Ina theannta sin, ní mór caighdeán amháin ar a laghad de thiúchan aitheanta a bheith ar fáil. Teastaíonn fluaraiméadar neamhspleách nó modúl fluaraiseachta atá comhtháite laistigh d’ionstraim eile chun an fluarafór a ghríosadh agus chun déine fhluaraiseachta an tsolais astaithe a thomhas. Caithfidh an trealamh agus an dath fluaraiseacha a bheith comhoiriúnach ionas go soláthróidh an fhoinse solais laistigh den uirlis an tonnfhad excitation riachtanach agus go tomhaiseann an brathadóir an solas a astaítear. Ag brath ar an gcineál ionstraime, tá na réitigh imoibrí suite i soithí imoibrithe le ballaí tanaí nó i cuvettes. Ní mór comhoiriúnacht leis an bhfeidhmchlár sonrach maidir le feistiú, trédhearcacht, uathfhluaraiseacht agus toirt a chur san áireamh.
Conas a chuirtear an modh i gcrích?
Taispeánann Figiúr 2 seicheamh tomhais fluairiméadracha. Cuirtear tús le hullmhú an bhána, na gcaighdeán agus an tsampla tríd an dath fluaraiseachta a chur leis, agus tréimhse goir ghearr ina dhiaidh sin. Ar dtús, déantar caighdeán amháin nó níos mó de chomhchruinnithe aitheanta a thomhas chun an cuar caighdeánach a ghiniúint. Déantar tiúchan an tsampla a chinneadh ina dhiaidh sin sa dara céim, ina ndéantar déine fluaraiseachta tomhaiste na samplaí a mheas i gcomparáid leis an gcuar caighdeánach.
Fluaraiseacht – modh roghnaithe?
Fiú má tá buntáistí ag baint le fluairiméadracht i gcásanna áirithe, leanann speictrophotiméadracht clasaiceach UV-Vis de bheith mar an modh caighdeánach maidir le haigéid núicléacha agus próitéiní a chainníochtú. Ceadaíonn speictrophotiméadracht íonacht an tsampla a fhíorú, agus is féidir anailís dhíreach a dhéanamh ar réitigh an-chomhchruinnithe. Ag brath ar cháilíocht an tsampla, chomh maith le riachtanais iarratais iartheachtacha, b’fhéidir go mbeadh sé inmholta an dá theicníc a chomhcheangal.
Is trádmharc cláraithe é PicoGreen ® de Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, NÓ, SAM. Is trádmharcanna cláraithe de chuid Eppendorf AG, an Ghearmáin iad Eppendorf ® , an Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® agus Eppendorf µCuvette ® ® . Gach ceart ar cosaint lena n-áirítear grafaic agus íomhánna. Cóipcheart © 2019 Eppendorf AG.
