This post is also available in:
Nederlands (Nederländska) 
English (Engelska) 
Français (Franska) 
polski (Polska) 
Español (Spanska) 
Български (Bulgariska) 
Čeština (Tjeckiska) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estniska) 
Deutsch (Tyska) 
Gaeilge (Irländska) 
Italiano (Italienska) 
한국어 (Koreanska) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norskt Bokmål) 
Português (Portugisiska, Portugal)
Kvantifiering av nukleinsyror och proteiner utförs rutinmässigt med användning av UV-Vis-spektrofotometri; dock ibland kan detektion via fluorescens visa sig vara mer fördelaktigt. I det här fallet detekteras inte molekyler genom absorbans, utan de detekteras på ett indirekt sätt – via signalen från ett fluorescerande färgämne. Fluorescens erbjuder inte bara en mycket känslig detektionsmetod, utan den tillåter selektiv mätning av individuella analyter.
Fall 1: Hur går jag vidare med lågkoncentrationsprovlösningar?
UV-Vis-spektrofotometri är inte särskilt känslig – för att få korrekta och exakta data bör provkoncentrationerna därför inte tillåtas sjunka under en viss koncentrationströskel. För dsDNA är denna nedre gräns cirka 1 µg/ml. Även om den nedre gränsen för detektion av fotometern inte har nåtts, är effekten av mätonoggrannhet i detta intervall avsevärd, och resulterande värden kan vara benägna att variera avsevärt. Fluorometrisk analys, som är 1000 gånger känsligare än absorbansmetoden, kan kvantifiera provlösningar med extremt låga koncentrationer mycket exakt.
Fall 2: Hur kan jag utföra korrekt kvantifiering trots provkontamination?
Förutom kvantifiering av nukleinsyror vid 260 nm, erbjuder UV-Vis-spektrofotometri möjligheten att bestämma provets renhet genom att använda ytterligare våglängder (230 nm, 280 nm, 320 nm), respektive en våglängdsskanning. Dataanalys kommer att möjliggöra slutsatser om förekomsten av ämnen som salt, proteiner eller fasta partiklar. Om däremot absorbansspektra är för lika, vilket är fallet för de olika nukleinsyrorna, kommer absorbansen ensam inte att kunna skilja på till exempel RNA och DNA. I detta fall kommer fluorescensmätningar att möjliggöra specifik kvantifiering av analyter, utan störningar från andra molekyler.
På vilken princip bygger denna metod?
Fluorescensmätningar drar fördel av fenomenet att vissa molekyler kan avge energi i form av ljus. För detektion av biomolekyler som nukleinsyror och proteiner väljs ett fluorescerande färgämne som kommer att binda till analyten med högsta möjliga specificitet. Bindningen av reagenset PicoGreen ® till dsDNA är ett klassiskt exempel. Efter excitation av komplexet med hjälp av ljus med en specifik våglängd (cirka 480 nm för PicoGreen), kommer fluoroforen att emittera ljus med lägre energi, dvs med en längre våglängd (ungefär 520 nm för PicoGreen) (figur 1). Ljuset mäts som relativ fluorescens (RFU), där intensiteten av fluorescensen är proportionell mot koncentrationen av provet.
A) Princip för fluorescensmätningar av nukleinsyror (vänster)
B) Ljuset som används för att excitera fluoroforen (EX) har en kortare våglängd än det emitterade ljuset (EM) (höger)
Vilka material krävs för denna metod?
Kvantifiering av nukleinsyror och proteiner drar nytta av valet av fluorescerande färgämnen som binder till sina respektive målmolekyler med hög specificitet. Dessutom måste minst en standard med känd koncentration finnas tillgänglig. Excitering av fluoroforen och mätning av fluorescensintensiteten hos det emitterade ljuset kräver antingen en fristående fluorometer eller en fluorescensmodul som är integrerad i ett annat instrument. Utrustning och fluorescerande färgämne måste vara kompatibla så att ljuskällan inuti instrumentet ger den eller de nödvändiga excitationsvåglängderna och detektorn mäter det emitterade ljuset. Beroende på typ av instrument är reagenslösningarna placerade antingen i tunnväggiga reaktionskärl eller i kyvetter. Kompatibilitet med den specifika applikationen med avseende på passform, transparens, autofluorescens och volym måste beaktas.
Hur går metoden till?
Figur 2 visar sekvensen av en fluorometrisk mätning. Beredning av blindprovet, standarderna och provet initieras genom tillsats av det fluorescerande färgämnet, följt av en kort inkubationsperiod. Först mäts en eller flera standarder av kända koncentrationer för att generera standardkurvan. Bestämning av provkoncentration sker därefter i ett andra steg, där provernas uppmätta fluorescensintensiteter utvärderas i förhållande till standardkurvan.
Fluorescens – valmetod?
Även om fluorometri erbjuder fördelar i vissa fall, fortsätter klassisk UV-Vis-spektrofotometri att vara standardmetoden när det gäller kvantifiering av nukleinsyror och proteiner. Spektrofotometri tillåter verifiering av provets renhet och högkoncentrerade lösningar kan analyseras direkt. Beroende på kvaliteten på provet, såväl som kraven för nedströmsapplikationer, kan det vara tillrådligt att kombinera båda teknikerna.
PicoGreen ® är ett registrerat varumärke som tillhör Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® och Eppendorf µCuvette ® är registrerade varumärken som tillhör Eppendorf AG, Tyskland. Alla rättigheter reserverade inklusive grafik och bilder. Copyright © 2019 Eppendorf AG.
