This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Esperanta (Esperanto) 
Deutsch (German) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
Nukleiinhapete ja valkude kvantifitseerimine toimub rutiinselt UV-Vis spektrofotomeetria abil; kuid mõnikord võib fluorestsentsi abil tuvastamine osutuda soodsamaks. Sel juhul ei tuvastata molekule neeldumise kaudu, vaid need tuvastatakse kaudselt – fluorestseeruva värvaine signaali kaudu. Fluorestsents ei paku mitte ainult väga tundlikku tuvastamismeetodit, vaid võimaldab ka üksikute analüütide selektiivset mõõtmist.
1. juhtum: kuidas jätkata madala kontsentratsiooniga proovilahustega?
UV-Vis spektrofotomeetria ei ole väga tundlik – täpsete ja täpsete andmete saamiseks ei tohiks seetõttu lasta proovide kontsentratsioonidel langeda alla teatud kontsentratsiooniläve. DsDNA puhul on see alumine piir ligikaudu 1 µg/ml. Isegi kui fotomeetri alumine tuvastuspiir ei ole saavutatud, on mõõtmise ebatäpsuse mõju selles vahemikus märkimisväärne ja sellest tulenevad väärtused võivad oluliselt muutuda. Fluoromeetriline analüüs, mis on 1000 korda tundlikum kui neeldumismeetod, suudab väga täpselt kvantifitseerida väga madala kontsentratsiooniga proovilahuseid.
2. juhtum: kuidas saan teha täpset kvantifitseerimist hoolimata proovi saastumisest?
Lisaks nukleiinhapete kvantifitseerimisele 260 nm juures pakub UV-Vis spektrofotomeetria võimalust määrata proovi puhtust, kasutades vastavalt täiendavaid lainepikkusi (230 nm, 280 nm, 320 nm) või lainepikkuse skaneerimist. Andmete analüüs võimaldab teha järeldusi selliste ainete, nagu sool, valgud või tahked osakesed, olemasolu kohta. Kui aga neeldumisspektrid on liiga sarnased, nagu erinevate nukleiinhapete puhul, ei suuda ainuüksi neeldumine eristada näiteks RNA-d ja DNA-d. Sel juhul võimaldavad fluorestsentsi mõõtmised analüütide spetsiifilist kvantifitseerimist ilma teiste molekulide sekkumiseta.
Mis põhimõttel see meetod põhineb?
Fluorestsentsmõõtmised kasutavad ära nähtust, et teatud molekulid on võimelised kiirgama energiat valguse kujul. Biomolekulide, nagu nukleiinhapped ja valgud, tuvastamiseks valitakse fluorestseeruv värv, mis seondub analüüdiga võimalikult suure spetsiifilisusega. Klassikaline näide on PicoGreen® reaktiivi sidumine dsDNA- ga . Pärast kompleksi ergastamist kindla lainepikkusega valgusega (ligikaudu 480 nm PicoGreeni puhul) kiirgab fluorofoor madalama energiaga valgust, st pikema lainepikkusega (ligikaudu 520 nm PicoGreeni puhul) (joonis 1). Valgust mõõdetakse suhtelise fluorestsentsina (RFU), kus fluorestsentsi intensiivsus on võrdeline proovi kontsentratsiooniga.
A) Nukleiinhapete fluorestsentsi mõõtmise põhimõte (vasakul)
B) Fluorofoori (EX) ergastamiseks kasutatava valguse lainepikkus on lühem kui kiiratud valgusel (EM) (paremal)
Milliseid materjale on selle meetodi jaoks vaja?
Nukleiinhapete ja valkude kvantifitseerimine tuleb kasuks fluorestseeruvate värvainete valikust, mis seonduvad nende vastava sihtmolekuliga kõrge spetsiifilisusega. Lisaks peab olema saadaval vähemalt üks teadaoleva kontsentratsiooniga standard. Fluorofoori ergastamiseks ja kiiratava valguse fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmiseks on vaja kas eraldiseisvat fluoromeetrit või fluorestsentsmoodulit, mis on integreeritud teise seadmesse. Seadmed ja fluorestsentsvärv peavad ühilduma nii, et instrumendi sees olev valgusallikas annaks nõutava(d) ergastuslainepikkuse(d) ja detektor mõõdaks kiiratavat valgust. Olenevalt instrumendi tüübist paiknevad reaktiivilahused kas õhukeseseinalistes reaktsioonianumates või küvettides. Arvesse tuleb võtta sobivust konkreetse rakendusega sobivuse, läbipaistvuse, automaatse fluorestsentsi ja mahu osas.
Kuidas meetodit teostatakse?
Joonisel 2 on näidatud fluoromeetrilise mõõtmise järjekord. Pimekatse, standardite ja proovi ettevalmistamine alustatakse fluorestsentsvärvi lisamisega, millele järgneb lühike inkubatsiooniperiood. Esiteks mõõdetakse üht või mitut teadaolevate kontsentratsioonidega standardit, et luua standardkõver. Seejärel määratakse proovi kontsentratsioon teises etapis, kus proovide mõõdetud fluorestsentsi intensiivsust hinnatakse standardkõvera suhtes.
Fluorestsents – valikmeetod?
Isegi kui fluoromeetria pakub teatud juhtudel eeliseid, on klassikaline UV-Vis spektrofotomeetria endiselt standardmeetod nukleiinhapete ja valkude kvantifitseerimisel. Spektrofotomeetria võimaldab kontrollida proovi puhtust ja väga kontsentreeritud lahuseid saab otse analüüsida. Sõltuvalt proovi kvaliteedist ja järgnevate rakenduste nõuetest võib olla soovitatav kombineerida mõlemat tehnikat.
PicoGreen ® on Molecular Probes, Inc. registreeritud kaubamärk. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® ja Eppendorf µCuvette ® on Eppendorf AG, Saksamaa registreeritud kaubamärgid. Kõik õigused kaitstud, sealhulgas graafika ja pildid. Autoriõigus © 2019 Eppendorf AG.
