This post is also available in:
Nederlands (Dutch) 
English 
Français (French) 
polski (Polish) 
Español (Spanish) 
Български (Bulgarian) 
Čeština (Czech) 
Eesti (Estonian) 
Deutsch (German) 
Gaeilge (Irish) 
Italiano (Italian) 
한국어 (Korean) 
Melayu (Malay) 
Norsk bokmål (Norwegian Bokmål) 
Português (Portuguese, Portugal) 
Svenska (Swedish)
Kvantigo de nukleaj acidoj kaj proteinoj estas rutine farita uzante UV-Vis-spektrofotometrion; tamen, foje, detekto per fluoreskeco povas pruvi esti pli favora. En ĉi tiu kazo, molekuloj ne estas detektitaj per absorbado, sed ili estas detektitaj en nerekta modo – per la signalo de fluoreska tinkturfarbo. Ne nur fluoreskeco ofertas tre senteman detektmetodon, sed ĝi permesas selekteman mezuradon de individuaj analitoj.
Kazo 1: Kiel mi procedu kun malaltaj koncentriĝaj specimenaj solvoj?
UV-Vis-spektrofotometrio ne estas tre sentema – por akiri precizajn kaj precizajn datenojn, specimenaj koncentriĝoj devus do ne esti permesitaj fali sub certa koncentriĝsojlo. Por dsDNA, tiu pli malalta limo estas proksimume 1 µg/mL. Eĉ se la malsupra limo de detekto de la fotometro ne estis atingita, la efiko de mezurmalprecizeco en tiu intervalo estas konsiderinda, kaj rezultaj valoroj povas esti emaj al granda vario. Fluorometria analizo, estante 1000-oble pli sentema ol la absorbadmetodo, kapablas kvantigi provaĵsolvojn de ekstreme malaltaj koncentriĝoj tre precize.
Kazo 2: Kiel mi povas plenumi precizan kvantigon malgraŭ specimena poluado?
Aldone al kvantigo de nukleaj acidoj je 260 Nm, UV-Vis-spektrofotometrio ofertas la opcion de determinado de provaĵopureco uzante kromajn ondolongojn (230 Nm, 280 Nm, 320 Nm), aŭ ondolongskanadon, respektive. Analizo de datumoj permesos konkludojn pri la ĉeesto de substancoj kiel salo, proteinoj aŭ solidaj partikloj. Se, aliflanke, la absorbadspektroj estas tro similaj, kiel estas la kazo por la malsamaj nukleaj acidoj, absorbo sole ne povos distingi inter, ekzemple, RNA kaj DNA. En ĉi tiu kazo, fluoreskecaj mezuradoj permesos la specifan kvantigon de analitoj, sen interfero de aliaj molekuloj.
Sur kiu principo baziĝas tiu ĉi metodo?
Fluoreskmezuradoj ekspluatas la fenomenon ke certaj molekuloj kapablas elsendi energion en formo de lumo. Por la detekto de biomolekuloj kiel ekzemple nukleaj acidoj kaj proteinoj, fluoreska tinkturfarbo estas elektita kiu ligos al la analito kun la plej alta ebla specifeco. La ligo de la reakciilo PicoGreen ® al dsDNA estas klasika ekzemplo. Post ekscito de la komplekso uzante lumon de specifa ondolongo (ĉirkaŭ 480 nm por PicoGreen), la fluoroforo elsendos lumon de pli malalta energio, te de pli longa ondolongo (ĉirkaŭ 520 nm por PicoGreen) (figuro 1). La lumo estas mezurita kiel relativa fluoreskeco (RFU), kie la intenseco de la fluoreskeco estas proporcia al la koncentriĝo de la provaĵo.
A) Principo de fluoreskecaj mezuradoj de nukleaj acidoj (maldekstre)
B) La lumo kiu estas utiligita por eksciti la fluoroforon (EX) havas pli mallongan ondolongon ol la elsendita lumo (EM) (dekstra)
Kiuj materialoj estas bezonataj por ĉi tiu metodo?
Kvantigo de nukleaj acidoj kaj proteinoj profitas el la elekto de fluoreskaj tinkturfarboj kiuj ligas al sia respektiva celmolekulo kun alta specifeco. Krome, almenaŭ unu normo de konata koncentriĝo devas esti havebla. Ekscito de la fluoroforo kaj mezurado de la fluoreskecintenseco de la elsendita lumo postulas aŭ memstaran fluorometron aŭ fluoreskecmodulon kiu estas integrita ene de alia instrumento. Ekipaĵo kaj fluoreska tinkturfarbo devas esti kongruaj tiel ke la lumfonto ene de la instrumento disponigas la postulatan ekscitlongon (j) kaj la detektilo mezuras la lumon elsenditan. Depende de la speco de instrumento, la reakciigsolvoj situas aŭ en maldikmuraj reagujoj aŭ en kuvetoj. Kongruo kun la specifa apliko rilate al taŭgeco, travidebleco, aŭto-fluoresko kaj volumeno devas esti konsiderata.
Kiel estas efektivigita la metodo?
Figuro 2 montras la sekvencon de fluorometria mezurado. Preparado de la malplena, la normoj kaj la specimeno estas komencita per aldono de la fluoreska tinkturfarbo, sekvita de mallonga inkubacio. Unue, unu aŭ pluraj normoj de konataj koncentriĝoj estas mezuritaj por generi la norman kurbon. Determino de specimena koncentriĝo poste okazas en dua paŝo, kie la mezuritaj fluoreskecaj intensecoj de la provaĵoj estas taksitaj rilate al la norma kurbo.
Fluoresko – elektebla metodo?
Eĉ se fluorometrio ofertas avantaĝojn en certaj kazoj, klasika UV-Vis-spektrofotometrio daŭre estas la norma metodo kiam ĝi venas al kvantigado de nukleaj acidoj kaj proteinoj. Spektrofotometrio permesas konfirmon de provaĵopureco, kaj tre densaj solvoj povas esti analizitaj rekte. Depende de la kvalito de la specimeno, same kiel de la postuloj de kontraŭfluaj aplikoj, povas esti konsilinde kombini ambaŭ teknikojn.
PicoGreen ® estas registrita varmarko de Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, Usono. Eppendorf ® , la Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® kaj Eppendorf µCuvette ® estas registritaj varmarkoj de Eppendorf AG, Germanio. Ĉiuj rajtoj rezervitaj inkluzive de grafikaĵoj kaj bildoj. Kopirajto © 2019 Eppendorf AG.
