This post is also available in:
Nederlands (Holandský) 
English (Angličtina) 
Français (Francouzština) 
polski (Polský) 
Español (Španělský) 
Български (Bulharština) 
Esperanta (Esperanto) 
Eesti (Estonština) 
Deutsch (Němec) 
Gaeilge (Irský) 
Italiano (Ital) 
한국어 (Korejský) 
Melayu (Malajský) 
Norsk bokmål (Norwegian bokmål) 
Português (Portugalština ( Portugalsko)) 
Svenska (Švédský)
Kvantifikace nukleových kyselin a proteinů se běžně provádí pomocí UV-Vis spektrofotometrie; někdy se však může ukázat jako výhodnější detekce pomocí fluorescence. V tomto případě molekuly nejsou detekovány absorbancí, ale jsou detekovány nepřímým způsobem – prostřednictvím signálu fluorescenčního barviva. Nejen, že fluorescence nabízí vysoce citlivou metodu detekce, ale umožňuje selektivní měření jednotlivých analytů.
Případ 1: Jak mám postupovat s roztoky vzorků s nízkou koncentrací?
UV-Vis spektrofotometrie není příliš citlivá – pro získání přesných a přesných údajů by proto koncentrace vzorků neměla klesnout pod určitou koncentrační hranici. Pro dsDNA je tato spodní hranice přibližně 1 µg/ml. I když nebylo dosaženo dolní meze detekce fotometru, dopad nepřesnosti měření v tomto rozsahu je značný a výsledné hodnoty mohou být náchylné k podstatným změnám. Fluorometrická analýza, která je 1000krát citlivější než metoda absorbance, je schopna velmi přesně kvantifikovat roztoky vzorků s extrémně nízkými koncentracemi.
Případ 2: Jak mohu provést přesnou kvantifikaci navzdory kontaminaci vzorku?
Kromě kvantifikace nukleových kyselin při 260 nm nabízí UV-Vis spektrofotometrie možnost stanovení čistoty vzorku využitím dalších vlnových délek (230 nm, 280 nm, 320 nm), resp. Analýza dat umožní učinit závěry týkající se přítomnosti látek, jako je sůl, proteiny nebo pevné částice. Pokud jsou naopak absorbanční spektra příliš podobná, jako je tomu u různých nukleových kyselin, samotná absorbance nebude schopna rozlišit například RNA a DNA. V tomto případě fluorescenční měření umožní specifickou kvantifikaci analytů bez interference s jinými molekulami.
Na jakém principu je tato metoda založena?
Měření fluorescence využívá jevu, že určité molekuly jsou schopny vyzařovat energii ve formě světla. Pro detekci biomolekul, jako jsou nukleové kyseliny a proteiny, se vybere fluorescenční barvivo, které se naváže na analyt s nejvyšší možnou specificitou. Klasickým příkladem je vazba činidla PicoGreen ® na dsDNA. Po excitaci komplexu světlem o specifické vlnové délce (přibližně 480 nm pro PicoGreen) bude fluorofor emitovat světlo s nižší energií, tj. s delší vlnovou délkou (přibližně 520 nm pro PicoGreen) (obrázek 1). Světlo se měří jako relativní fluorescence (RFU), kde intenzita fluorescence je úměrná koncentraci vzorku.
A) Princip fluorescenčních měření nukleových kyselin (vlevo)
B) Světlo, které se používá k excitaci fluoroforu (EX), má kratší vlnovou délku než emitované světlo (EM) (vpravo)
Jaké materiály jsou pro tuto metodu zapotřebí?
Kvantifikace nukleových kyselin a proteinů těží z výběru fluorescenčních barviv, která se vážou na příslušnou cílovou molekulu s vysokou specificitou. Kromě toho musí být k dispozici alespoň jeden standard o známé koncentraci. Excitace fluoroforu a měření intenzity fluorescence emitovaného světla vyžaduje buď samostatný fluorometr, nebo fluorescenční modul, který je integrován v jiném přístroji. Vybavení a fluorescenční barvivo musí být kompatibilní, aby zdroj světla uvnitř přístroje poskytoval požadovanou vlnovou délku (y) excitace a detektor měřil emitované světlo. V závislosti na typu přístroje jsou roztoky činidel umístěny buď v tenkostěnných reakčních nádobkách nebo v kyvetách. Je třeba vzít v úvahu kompatibilitu s konkrétní aplikací s ohledem na přizpůsobení, průhlednost, autofluorescenci a objem.
Jak se metoda provádí?
Obrázek 2 ukazuje sekvenci fluorometrického měření. Příprava slepého vzorku, standardů a vzorku je zahájena přidáním fluorescenčního barviva, po kterém následuje krátká inkubační doba. Nejprve se změří jeden nebo více standardů o známých koncentracích, aby se vytvořila standardní křivka. Stanovení koncentrace vzorku následně probíhá ve druhém kroku, kde jsou naměřené intenzity fluorescence vzorků hodnoceny ve vztahu ke standardní křivce.
Fluorescence – metoda volby?
I když fluorometrie nabízí v určitých případech výhody, klasická UV-Vis spektrofotometrie nadále zůstává standardní metodou, pokud jde o kvantifikaci nukleových kyselin a proteinů. Spektrofotometrie umožňuje ověření čistoty vzorku a vysoce koncentrované roztoky lze analyzovat přímo. V závislosti na kvalitě vzorku a také na požadavcích následných aplikací může být vhodné obě techniky kombinovat.
PicoGreen ® je registrovaná ochranná známka společnosti Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf ® , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® a Eppendorf µCuvette ® jsou registrované ochranné známky společnosti Eppendorf AG, Německo. Všechna práva včetně grafiky a obrázků vyhrazena. Copyright © 2019 Eppendorf AG.
