This post is also available in:
Nederlands (Холандски) 
English (Английски) 
Français (Френски) 
polski (Полски) 
Español (Испански) 
Čeština (Чешки) 
Esperanta (Есперанто) 
Eesti (Естонски) 
Deutsch (Немски) 
Gaeilge (Ирландски) 
Italiano (Италиански) 
한국어 (Корейски) 
Melayu (Малайски) 
Norsk bokmål (Норвежки книжовен) 
Português (Португалски (Португалия)) 
Svenska (Шведски)
Количественото определяне на нуклеинови киселини и протеини се извършва рутинно с помощта на UV-Vis спектрофотометрия; въпреки това, понякога откриването чрез флуоресценция може да се окаже по-благоприятно. В този случай молекулите не се откриват чрез абсорбция, а се откриват по индиректен начин – чрез сигнала на флуоресцентно багрило. Флуоресценцията не само предлага високочувствителен метод за откриване, но позволява селективно измерване на отделни аналити.
Случай 1: Как да процедирам с пробни разтвори с ниска концентрация?
UV-Vis спектрофотометрията не е много чувствителна – за да се получат точни и прецизни данни, следователно не трябва да се позволява концентрациите на пробата да паднат под определен праг на концентрация. За dsDNA тази долна граница е приблизително 1 µg/mL. Дори ако долната граница на откриване на фотометъра не е достигната, въздействието на неточността на измерване в този диапазон е значително и получените стойности могат да бъдат склонни към значителни вариации. Флуорометричният анализ, който е 1000 пъти по-чувствителен от метода на абсорбция, е способен да определи количествено разтвори на проби с изключително ниски концентрации много точно.
Случай 2: Как мога да извърша точно количествено определяне въпреки замърсяването на пробата?
В допълнение към количественото определяне на нуклеиновите киселини при 260 nm, UV-Vis спектрофотометрията предлага възможност за определяне на чистотата на пробата чрез използване на допълнителни дължини на вълната (230 nm, 280 nm, 320 nm) или съответно сканиране на дължината на вълната. Анализът на данните ще позволи да се направят заключения относно наличието на вещества като сол, протеини или твърди частици. Ако, от друга страна, спектрите на абсорбция са твърде сходни, какъвто е случаят с различните нуклеинови киселини, абсорбцията сама по себе си няма да може да направи разлика между, например, РНК и ДНК. В този случай измерванията на флуоресценция ще позволят специфичното количествено определяне на аналитите, без намеса от други молекули.
На кой принцип се основава този метод?
Флуоресцентните измервания се възползват от явлението, че определени молекули са способни да излъчват енергия под формата на светлина. За откриване на биомолекули като нуклеинови киселини и протеини се избира флуоресцентно багрило, което ще се свърже с аналита с възможно най-висока специфичност. Свързването на реагента PicoGreen ® с dsDNA е класически пример. След възбуждане на комплекса с помощта на светлина със специфична дължина на вълната (приблизително 480 nm за PicoGreen), флуорофорът ще излъчва светлина с по-ниска енергия, т.е. с по-голяма дължина на вълната (приблизително 520 nm за PicoGreen) (фигура 1). Светлината се измерва като относителна флуоресценция (RFU), където интензитетът на флуоресценцията е пропорционален на концентрацията на пробата.
A) Принцип на измерване на флуоресценцията на нуклеиновите киселини (вляво)
Б) Светлината, която се използва за възбуждане на флуорофора (EX), има по-къса дължина на вълната от излъчваната светлина (EM) (вдясно)
Какви материали са необходими за този метод?
Количественото определяне на нуклеиновите киселини и протеините се възползва от избора на флуоресцентни багрила, които се свързват със съответната им целева молекула с висока специфичност. Освен това трябва да е наличен поне един стандарт с известна концентрация. Възбуждането на флуорофора и измерването на интензитета на флуоресценция на излъчваната светлина изискват или самостоятелен флуорометър, или флуоресцентен модул, който е интегриран в друг инструмент. Оборудването и флуоресцентното багрило трябва да са съвместими, така че източникът на светлина вътре в инструмента да осигурява необходимата дължина(и) на вълната на възбуждане и детекторът да измерва излъчваната светлина. В зависимост от вида на инструмента, разтворите на реагентите се намират или в тънкостенни реакционни съдове, или в кювети. Трябва да се вземе предвид съвместимостта със специфичното приложение по отношение на прилягането, прозрачността, автофлуоресценцията и обема.
Как се осъществява методът?
Фигура 2 показва последователността на флуорометрично измерване. Приготвянето на празната проба, стандартите и пробата се започва с добавяне на флуоресцентно багрило, последвано от кратък инкубационен период. Първо, един или повече стандарти с известни концентрации се измерват, за да се генерира стандартната крива. След това определянето на концентрацията на пробата се извършва във втора стъпка, където измерените интензитети на флуоресценция на пробите се оценяват по отношение на стандартната крива.
Флуоресценция – метод на избор?
Дори ако флуорометрията предлага предимства в определени случаи, класическата UV-Vis спектрофотометрия продължава да бъде стандартен метод, когато става въпрос за количествено определяне на нуклеинови киселини и протеини. Спектрофотометрията позволява проверка на чистотата на пробата, а силно концентрираните разтвори могат да бъдат анализирани директно. В зависимост от качеството на пробата, както и от изискванията на приложенията надолу по веригата, може да е препоръчително да се комбинират и двете техники.
PicoGreen ® е регистрирана търговска марка на Molecular Probes, Inc. Корпорация, Юджийн, Орегон, САЩ. Eppendorf ® , дизайнът на марката Eppendorf, Eppendorf BioSpectrometer ® , Uvette ® и Eppendorf µCuvette ® са регистрирани търговски марки на Eppendorf AG, Германия. Всички права запазени, включително графики и изображения. Авторско право © 2019 Eppendorf AG.
