UV-Vis-spektrofotometri \u00e4r inte s\u00e4rskilt k\u00e4nslig \u2013 f\u00f6r att f\u00e5 korrekta och exakta data b\u00f6r provkoncentrationerna d\u00e4rf\u00f6r inte till\u00e5tas sjunka under en viss koncentrationstr\u00f6skel. F\u00f6r dsDNA \u00e4r denna nedre gr\u00e4ns cirka 1 \u00b5g\/ml. \u00c4ven om den nedre gr\u00e4nsen f\u00f6r detektion av fotometern inte har n\u00e5tts, \u00e4r effekten av m\u00e4tonoggrannhet i detta intervall avsev\u00e4rd, och resulterande v\u00e4rden kan vara ben\u00e4gna att variera avsev\u00e4rt. Fluorometrisk analys, som \u00e4r 1000 g\u00e5nger k\u00e4nsligare \u00e4n absorbansmetoden, kan kvantifiera provl\u00f6sningar med extremt l\u00e5ga koncentrationer mycket exakt.<\/p>\n\n
Fall 2: Hur kan jag utf\u00f6ra korrekt kvantifiering trots provkontamination?<\/strong><\/p>\n\n F\u00f6rutom kvantifiering av nukleinsyror vid 260 nm, erbjuder UV-Vis-spektrofotometri m\u00f6jligheten att best\u00e4mma provets renhet genom att anv\u00e4nda ytterligare v\u00e5gl\u00e4ngder (230 nm, 280 nm, 320 nm), respektive en v\u00e5gl\u00e4ngdsskanning. Dataanalys kommer att m\u00f6jligg\u00f6ra slutsatser om f\u00f6rekomsten av \u00e4mnen som salt, proteiner eller fasta partiklar. Om d\u00e4remot absorbansspektra \u00e4r f\u00f6r lika, vilket \u00e4r fallet f\u00f6r de olika nukleinsyrorna, kommer absorbansen ensam inte att kunna skilja p\u00e5 till exempel RNA och DNA. I detta fall kommer fluorescensm\u00e4tningar att m\u00f6jligg\u00f6ra specifik kvantifiering av analyter, utan st\u00f6rningar fr\u00e5n andra molekyler.<\/p>\n\n P\u00e5 vilken princip bygger denna metod?<\/strong><\/p>\n\n Fluorescensm\u00e4tningar drar f\u00f6rdel av fenomenet att vissa molekyler kan avge energi i form av ljus. F\u00f6r detektion av biomolekyler som nukleinsyror och proteiner v\u00e4ljs ett fluorescerande f\u00e4rg\u00e4mne som kommer att binda till analyten med h\u00f6gsta m\u00f6jliga specificitet. Bindningen av reagenset PicoGreen \u00ae<\/sup> till dsDNA \u00e4r ett klassiskt exempel. Efter excitation av komplexet med hj\u00e4lp av ljus med en specifik v\u00e5gl\u00e4ngd (cirka 480 nm f\u00f6r PicoGreen), kommer fluoroforen att emittera ljus med l\u00e4gre energi, dvs med en l\u00e4ngre v\u00e5gl\u00e4ngd (ungef\u00e4r 520 nm f\u00f6r PicoGreen) (figur 1). Ljuset m\u00e4ts som relativ fluorescens (RFU), d\u00e4r intensiteten av fluorescensen \u00e4r proportionell mot koncentrationen av provet.<\/p>\n\n Vilka material kr\u00e4vs f\u00f6r denna metod?<\/strong><\/p>\n\n Kvantifiering av nukleinsyror och proteiner drar nytta av valet av fluorescerande f\u00e4rg\u00e4mnen som binder till sina respektive m\u00e5lmolekyler med h\u00f6g specificitet. Dessutom m\u00e5ste minst en standard med k\u00e4nd koncentration finnas tillg\u00e4nglig. Excitering av fluoroforen och m\u00e4tning av fluorescensintensiteten hos det emitterade ljuset kr\u00e4ver antingen en frist\u00e5ende fluorometer eller en fluorescensmodul som \u00e4r integrerad i ett annat instrument. Utrustning och fluorescerande f\u00e4rg\u00e4mne m\u00e5ste vara kompatibla s\u00e5 att ljusk\u00e4llan inuti instrumentet ger den eller de n\u00f6dv\u00e4ndiga excitationsv\u00e5gl\u00e4ngderna och detektorn m\u00e4ter det emitterade ljuset. Beroende p\u00e5 typ av instrument \u00e4r reagensl\u00f6sningarna placerade antingen i tunnv\u00e4ggiga reaktionsk\u00e4rl eller i kyvetter. Kompatibilitet med den specifika applikationen med avseende p\u00e5 passform, transparens, autofluorescens och volym m\u00e5ste beaktas.<\/p>\n\n Hur g\u00e5r metoden till?<\/strong><\/p>\n\n Figur 2 visar sekvensen av en fluorometrisk m\u00e4tning. Beredning av blindprovet, standarderna och provet initieras genom tillsats av det fluorescerande f\u00e4rg\u00e4mnet, f\u00f6ljt av en kort inkubationsperiod. F\u00f6rst m\u00e4ts en eller flera standarder av k\u00e4nda koncentrationer f\u00f6r att generera standardkurvan. Best\u00e4mning av provkoncentration sker d\u00e4refter i ett andra steg, d\u00e4r provernas uppm\u00e4tta fluorescensintensiteter utv\u00e4rderas i f\u00f6rh\u00e5llande till standardkurvan.<\/p>\n\n Fluorescens \u2013 valmetod?<\/strong><\/p>\n\n \u00c4ven om fluorometri erbjuder f\u00f6rdelar i vissa fall, forts\u00e4tter klassisk UV-Vis-spektrofotometri att vara standardmetoden n\u00e4r det g\u00e4ller kvantifiering av nukleinsyror och proteiner. Spektrofotometri till\u00e5ter verifiering av provets renhet och h\u00f6gkoncentrerade l\u00f6sningar kan analyseras direkt. Beroende p\u00e5 kvaliteten p\u00e5 provet, s\u00e5v\u00e4l som kraven f\u00f6r nedstr\u00f6msapplikationer, kan det vara tillr\u00e5dligt att kombinera b\u00e5da teknikerna. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg\")