Nukleinsyror isoleras fr\u00e5n provmaterial s\u00e5som celler och anv\u00e4nds d\u00e4refter i ytterligare laboratorieexperiment. F\u00f6r detta \u00e4ndam\u00e5l \u00e4r det tillr\u00e5dligt att best\u00e4mma koncentrationen av det renade DNA eller RNA samt verifiera deras renhet. P\u00e5 detta s\u00e4tt kommer noggrant definierade m\u00e4ngder av nukleinsyran in i nedstr\u00f6msapplikationen, och alla f\u00f6roreningar som kan p\u00e5verka en k\u00e4nslig reaktion eller analys detekteras i realtid.<\/p>\n\n
UV-Vis spektrofotometri \u00e4r en enkel, snabb och bepr\u00f6vad metod f\u00f6r att uppn\u00e5 dessa m\u00e5l. Inom intervallet 260 nm visar nukleinsyror en karakteristisk absorbanstopp (figur 1). Detta absorbansv\u00e4rde anv\u00e4nds d\u00e4rf\u00f6r f\u00f6r att ber\u00e4kna nukleinsyrakoncentrationer. Enligt Lambert-Beer-lagen kr\u00e4vs tv\u00e5 parametrar f\u00f6r ber\u00e4kning av koncentrationen av ett prov: den optiska v\u00e4gl\u00e4ngden (= ljusv\u00e4gsl\u00e4ngden (L)) och den mol\u00e4ra extinktionskoefficienten (material- och v\u00e5gl\u00e4ngdsspecifik konstant) f\u00f6r prov som ska m\u00e4tas. Den specifika faktorn (F) kan ber\u00e4knas vid anv\u00e4ndning av en standardkyvett med en ljusv\u00e4g p\u00e5 1 cm. Denna faktor multipliceras sedan med det uppm\u00e4tta absorbansv\u00e4rdet (A) f\u00f6r att komma fram till koncentrationen (C) av provl\u00f6sningen. Mol\u00e4ra extinktionskoefficienter respektive specifika faktorer \u00e4r typiskt tillg\u00e4ngliga i litteraturen. Faktorn f\u00f6r dsDNA \u00e4r till exempel 50 \u00b5g\/mL (RNA: 40 \u00b5g\/ml), och det motsvarar per definition en absorbansenhet. dessa uppgifter.<\/p>\n\n F\u00f6r att kunna g\u00f6ra ett uttalande om renheten hos ett nukleinsyraprov beh\u00f6ver absorbansen vid andra v\u00e5gl\u00e4ngder \u00e4n 260 nm best\u00e4mmas (figur 1). Kvotienterna h\u00e4rledda fr\u00e5n absorbansv\u00e4rdena uppm\u00e4tta vid 260 nm, 280 nm och 230 nm ( A260<\/sub> \/ A280<\/sub> och A260<\/sub> \/ A230<\/sub> ) utg\u00f6r de renhetsf\u00f6rh\u00e5llanden som hj\u00e4lper till att identifiera m\u00f6jliga f\u00f6roreningar. F\u00f6roreningar som proteiner och sp\u00e5r av reagens som anv\u00e4ndes under reningsprocessen ger ett annat absorbansspektrum \u00e4n nukleinsyror och p\u00e5verkar d\u00e4rmed renhetsf\u00f6rh\u00e5llandena (figur 2). A260<\/sub> \/ A280<\/sub> -f\u00f6rh\u00e5llandet f\u00f6r rena nukleinsyral\u00f6sningar kommer att vara ungef\u00e4r 1,8 – 2,0, medan f\u00f6rh\u00e5llandet A260<\/sub> \/ A230<\/sub> typiskt visar v\u00e4rden i intervallet 2,0 \u2013 2,5.<\/p>\n\n En fj\u00e4rde v\u00e5gl\u00e4ngd anv\u00e4nds f\u00f6r att best\u00e4mma bakgrunden. Den m\u00e4ts vid eller \u00f6ver 320 nm eftersom varken nukleinsyror eller organiska f\u00f6roreningar absorberar ljus vid denna v\u00e5gl\u00e4ngd. Absorbans m\u00e4tt i detta intervall kan indikera n\u00e4rvaron av partiklar eller luftbubblor i provet. \u00c4ven en utsmetad kyvett kan framkalla en bakgrundsavl\u00e4sning. Moderna fotometrar erbjuder m\u00f6jligheten att aktivera en bakgrundskorrigeringsfunktion som kommer att utf\u00f6ra automatisk subtraktion av eventuell bakgrundsabsorbans fr\u00e5n alla andra uppm\u00e4tta v\u00e4rden.<\/p>\n\n Dessutom kan det fullst\u00e4ndiga spektrumet av ett nukleinsyraprov f\u00e5ngas (vanligtvis mellan 220 och 320 nm). J\u00e4mf\u00f6relser med det spektrum som erh\u00e5lls fr\u00e5n en ren nukleinsyral\u00f6sning kommer att m\u00f6jligg\u00f6ra detektering av m\u00f6jliga fel under m\u00e4tningsprocessen s\u00e5v\u00e4l som n\u00e4rvaron av f\u00f6roreningar i provet.<\/p>\n\nLambert-Beer lag:<\/strong> C = Koncentration ![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_Two_Applications_389bfe613c.jpg\")