A espectrofotometria UV-Vis n\u00e3o \u00e9 muito sens\u00edvel \u2013 para obter dados precisos e precisos, as concentra\u00e7\u00f5es de amostras n\u00e3o devem, portanto, ser permitidas abaixo de um determinado limiar de concentra\u00e7\u00e3o. Para o dsDNA, este limite inferior \u00e9 de aproximadamente 1 \u03bcg\/mL. Mesmo que o limite inferior de dete\u00e7\u00e3o do fotometro n\u00e3o tenha sido atingido, o impacto da imprecis\u00e3o de medi\u00e7\u00e3o nesta gama \u00e9 consider\u00e1vel, e os valores resultantes podem ser propensos a uma varia\u00e7\u00e3o substancial. A an\u00e1lise fluorom\u00e9trica, sendo 1000 vezes mais sens\u00edvel do que o m\u00e9todo de absorv\u00e2ncia, \u00e9 capaz de quantificar solu\u00e7\u00f5es de amostra de concentra\u00e7\u00f5es extremamente baixas com muito precis\u00e3o.<\/p>\n\n
Caso 2: Como posso realizar uma quantifica\u00e7\u00e3o precisa apesar da contamina\u00e7\u00e3o da amostra?<\/strong><\/p>\n\n Para al\u00e9m da quantifica\u00e7\u00e3o dos \u00e1cidos nucleicos a 260 nm, a espectrofotometria UV-Vis oferece a op\u00e7\u00e3o de determinar a pureza da amostra utilizando comprimentos de onda adicionais (230 nm, 280 nm, 320 nm), ou um scan de comprimento de onda, respectivamente. A an\u00e1lise de dados permitir\u00e1 conclus\u00f5es sobre a presen\u00e7a de subst\u00e2ncias como sal, prote\u00ednas ou part\u00edculas s\u00f3lidas. Se, por outro lado, os espectros de absorv\u00e2ncia forem demasiado semelhantes, como \u00e9 o caso dos diferentes \u00e1cidos nucleicos, a absorv\u00e2ncia por si s\u00f3 n\u00e3o ser\u00e1 capaz de distinguir entre, por exemplo, ORN e o ADN. Neste caso, as medi\u00e7\u00f5es de fluoresc\u00eancia permitir\u00e3o a quantifica\u00e7\u00e3o espec\u00edfica de anal\u00edticas, sem interfer\u00eancia de outras mol\u00e9culas.<\/p>\n\n Em que princ\u00edpio se baseia este m\u00e9todo?<\/strong><\/p>\n\n As medi\u00e7\u00f5es de fluoresc\u00eancia aproveitam o fen\u00f3meno que certas mol\u00e9culas s\u00e3o capazes de emitir energia sob a forma de luz. Para a dete\u00e7\u00e3o de biomol\u00e9culas tais como \u00e1cidos nucleicos e prote\u00ednas, \u00e9 selecionado um corante fluorescente que se ligar\u00e1 \u00e0 subst\u00e2ncia com a maior especificidade poss\u00edvel. A liga\u00e7\u00e3o do reagente PicoGreen\u00ae<\/sup> ao DSDNA \u00e9 um exemplo cl\u00e1ssico. Ap\u00f3s a excita\u00e7\u00e3o do complexo utilizando a luz de um comprimento de onda espec\u00edfico (aproximadamente 480 nm para picoGreen), o fluor\u00f3foro emitir\u00e1 luz de menor energia, ou seja, de um comprimento de onda mais longo (aproximadamente 520 nm para PicoGreen) (figura 1). A luz \u00e9 medida como fluoresc\u00eancia relativa (RFU), onde a intensidade da fluoresc\u00eancia \u00e9 proporcional \u00e0 concentra\u00e7\u00e3o da amostra.<\/p>\n\n Que materiais s\u00e3o necess\u00e1rios para este m\u00e9todo?<\/strong><\/p>\n\n A quantifica\u00e7\u00e3o de \u00e1cidos nucleicos e prote\u00ednas beneficia da sele\u00e7\u00e3o de corantes fluorescentes que se ligam \u00e0 respetiva mol\u00e9cula-alvo com alta especificidade. Al\u00e9m disso, deve estar dispon\u00edvel pelo menos um padr\u00e3o de concentra\u00e7\u00e3o conhecida. A excita\u00e7\u00e3o do fluorophore e a medi\u00e7\u00e3o da intensidade da fluoresc\u00eancia da luz emitida requerem um fluor\u00f3metro aut\u00f3nomo ou um m\u00f3dulo de fluoresc\u00eancia que est\u00e1 integrado dentro de outro instrumento. O equipamento e o corante fluorescente devem ser compat\u00edveis de modo a que a fonte luminosa no interior do instrumento forne\u00e7a os comprimentos de onda de excita\u00e7\u00e3o necess\u00e1rios e o detetor mede a luz emitida. Dependendo do tipo de instrumento, as solu\u00e7\u00f5es de reagente est\u00e3o localizadas em recipientes de rea\u00e7\u00e3o de parede fina ou em cuvettes. Deve ser tida em conta a compatibilidade com a aplica\u00e7\u00e3o espec\u00edfica no que respeita \u00e0 adapta\u00e7\u00e3o, \u00e0 transpar\u00eancia, \u00e0 auto-fluoresc\u00eancia e ao volume.<\/p>\n\n Como \u00e9 executado o m\u00e9todo?<\/strong><\/p>\n\n A figura 2 mostra a sequ\u00eancia de uma medi\u00e7\u00e3o fluorom\u00e9trica. A prepara\u00e7\u00e3o do espa\u00e7o em branco, as normas e a amostra s\u00e3o iniciadas pela adi\u00e7\u00e3o do corante fluorescente, seguida de um curto per\u00edodo de incuba\u00e7\u00e3o. Em primeiro lugar, medem-se um ou mais padr\u00f5es de concentra\u00e7\u00f5es conhecidas para gerar a curva padr\u00e3o. Posteriormente, a determina\u00e7\u00e3o da concentra\u00e7\u00e3o da amostra ocorre num segundo passo, em que as intensidades de fluoresc\u00eancia medida das amostras s\u00e3o avaliadas em rela\u00e7\u00e3o \u00e0 curva-padr\u00e3o.<\/p>\n\n Fluoresc\u00eancia \u2013 m\u00e9todo de escolha?<\/strong><\/p>\n\n Mesmo que a fluorometria ofere\u00e7a vantagens em certos casos, a espectrofotometria cl\u00e1ssica UV-Vis continua a ser o m\u00e9todo padr\u00e3o quando se trata de quantifica\u00e7\u00e3o de \u00e1cidos e prote\u00ednas nucleicos. A espectrofotometria permite a verifica\u00e7\u00e3o da pureza da amostra, e as solu\u00e7\u00f5es altamente concentradas podem ser analisadas diretamente. Dependendo da qualidade da amostra, bem como dos requisitos das aplica\u00e7\u00f5es a jusante, pode ser aconselh\u00e1vel combinar ambas as t\u00e9cnicas. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
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