Os \u00e1cidos nucleicos s\u00e3o isolados de materiais de amostra, tais como c\u00e9lulas e subsequentemente utilizados em outras experi\u00eancias laboratoriais. Para o efeito, \u00e9 aconselh\u00e1vel determinar a concentra\u00e7\u00e3o do ADN ou do RNA purificados, bem como verificar a sua pureza. Desta forma, quantidades definidas com precis\u00e3o do \u00e1cido nucleico entrar\u00e3o na aplica\u00e7\u00e3o a jusante, e quaisquer contamina\u00e7\u00f5es que possam ter impacto numa rea\u00e7\u00e3o ou ensaio sens\u00edvel s\u00e3o detetadas em tempo real.<\/p>\n\n
A espectrofotometria UV-Vis \u00e9 um m\u00e9todo f\u00e1cil, r\u00e1pido e testado no tempo para atingir estes objetivos. Na gama de 260 nm, os \u00e1cidos nucleicos apresentam um pico de absorv\u00e2ncia caracter\u00edstico (figura 1). Este valor de absorv\u00e2ncia \u00e9, portanto, utilizado para calcular as concentra\u00e7\u00f5es de \u00e1cidos nucleicos. De acordo com a lei Lambert-Beer, s\u00e3o necess\u00e1rios dois par\u00e2metros para o c\u00e1lculo da concentra\u00e7\u00e3o de uma amostra: o comprimento do percurso \u00f3tico (= comprimento do caminho leve (L) e o coeficiente de extin\u00e7\u00e3o molar (constante espec\u00edfica do material e do comprimento de onda) da amostra a medir. O fator espec\u00edfico (F) pode ser calculado quando se utiliza uma cuvette padr\u00e3o com um caminho leve de 1 cm. Este fator \u00e9 ent\u00e3o multiplicado pelo valor de absorv\u00e2ncia medido (A) a fim de chegar \u00e0 concentra\u00e7\u00e3o (C) da solu\u00e7\u00e3o da amostra. Os coeficientes de extin\u00e7\u00e3o molar e os fatores espec\u00edficos, respectivamente, est\u00e3o tipicamente dispon\u00edveis na literatura. O fator para o dsDNA, por exemplo, \u00e9 de 50 \u03bcg\/mL (RNA: 40 \u03bcg\/mL), e \u00e9 por defini\u00e7\u00e3o equivalente a uma unidade de absorv\u00e2ncia. estes dados.<\/p>\n\n Para poder fazer uma declara\u00e7\u00e3o sobre a pureza de uma amostra de \u00e1cido nucleico, \u00e9 necess\u00e1rio determinar a absorv\u00e2ncia em comprimentos de onda que n\u00e3o sejam de 260 nm (figura 1). Os quocientes derivados dos valores de absorv\u00e2ncia medidos a 260 nm, 280 nm e 230 nm (A260<\/sub>\/A280<\/sub> e A260<\/sub>\/A230<\/sub>) constituem os r\u00e1cios de pureza que ajudam a identificar poss\u00edveis contamina\u00e7\u00f5es. Impurezas como prote\u00ednas e vest\u00edgios de reagentes que foram utilizados durante o processo de purifica\u00e7\u00e3o produzem um espectro de absorv\u00e2ncia diferente do dos \u00e1cidos nucleicos e, assim, influenciam os r\u00e1cios de pureza (figura 2). A rela\u00e7\u00e3o A260<\/sub>\/A280<\/sub> das solu\u00e7\u00f5es de \u00e1cido nucleico puro ser\u00e1 aproximadamente de 1,8 – 2,0, enquanto a raz\u00e3o A260<\/sub>\/A230<\/sub> apresentar\u00e1 tipicamente valores na gama de 2,0 – 2,5.<\/p>\n\n Um quarto comprimento de onda \u00e9 usado para determinar o fundo. Mede-se a 320 nm ou acima de 320 nm, uma vez que nem \u00e1cidos nucleicos nem contaminantes org\u00e2nicos absorvem a luz neste comprimento de onda. A absorv\u00e2ncia medida neste intervalo pode indicar a presen\u00e7a de part\u00edculas ou bolhas de ar dentro da amostra. At\u00e9 uma cuvette borrada \u00e9 capaz de provocar uma leitura de fundo. Os fotometros modernos oferecem a op\u00e7\u00e3o de ativar uma fun\u00e7\u00e3o de corre\u00e7\u00e3o de fundo que ir\u00e1 afetar a subtra\u00e7\u00e3o autom\u00e1tica de qualquer absorv\u00e2ncia de fundo de todos os outros valores medidos.<\/p>\n\n Al\u00e9m disso, pode ser capturado o espectro completo de uma amostra de \u00e1cido nucleico (normalmente entre 220 e 320 nm). As compara\u00e7\u00f5es com o espectro obtido a partir de uma solu\u00e7\u00e3o de \u00e1cido nucleico puro permitir\u00e3o a dete\u00e7\u00e3o de poss\u00edveis erros durante o processo de medi\u00e7\u00e3o, bem como a presen\u00e7a de contaminantes dentro da amostra.<\/p>\n\nLei Lambert-Beer: C = Concentra\u00e7\u00e3o ![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\")
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