{"id":9959,"date":"2022-02-28T12:10:57","date_gmt":"2022-02-28T12:10:57","guid":{"rendered":"https:\/\/cotslab.com\/fluorescencja-cenny-dodatek-do-absorbancji\/"},"modified":"2022-02-28T12:11:01","modified_gmt":"2022-02-28T12:11:01","slug":"fluorescencja-cenny-dodatek-do-absorbancji","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/fluorescencja-cenny-dodatek-do-absorbancji\/","title":{"rendered":"Fluorescencja: cenny dodatek do absorbancji?"},"content":{"rendered":"\n<p>Kwantyfikacja kwas\u00f3w nukleinowych i bia\u0142ek jest rutynowo przeprowadzana przy u\u017cyciu spektrofotometrii UV-Vis; jednak czasami wykrywanie za pomoc\u0105 fluorescencji mo\u017ce okaza\u0107 si\u0119 bardziej korzystne. W tym przypadku cz\u0105steczki nie s\u0105 wykrywane przez absorbancj\u0119, ale s\u0105 wykrywane w spos\u00f3b po\u015bredni \u2013 poprzez sygna\u0142 barwnika fluorescencyjnego. Fluorescencja nie tylko oferuje bardzo czu\u0142\u0105 metod\u0119 wykrywania, ale umo\u017cliwia selektywny pomiar poszczeg\u00f3lnych analit\u00f3w.<\/p>\n\n<p><strong>Przypadek 1: Jak post\u0119powa\u0107 z roztworami pr\u00f3bek o niskim st\u0119\u017ceniu?<\/strong><\/p>\n\n<p>Spektrofotometria UV-Vis nie jest bardzo czu\u0142a \u2013 w celu uzyskania dok\u0142adnych i precyzyjnych danych st\u0119\u017cenia pr\u00f3bek nie powinny zatem spa\u015b\u0107 poni\u017cej pewnego progu st\u0119\u017cenia. Dla dsDNA ta dolna granica wynosi oko\u0142o 1 \u00b5g\/ml. Nawet je\u015bli dolna granica wykrywalno\u015bci fotometru nie zosta\u0142a osi\u0105gni\u0119ta, wp\u0142yw niedok\u0142adno\u015bci pomiaru w tym zakresie jest znaczny, a otrzymane warto\u015bci mog\u0105 by\u0107 podatne na znaczne wahania. Analiza fluorometryczna, b\u0119d\u0105c 1000-krotnie bardziej czu\u0142a ni\u017c metoda absorbancji, umo\u017cliwia bardzo dok\u0142adne oznaczenie ilo\u015bciowe roztwor\u00f3w pr\u00f3bek o bardzo niskich st\u0119\u017ceniach.<\/p>\n\n<p><strong>Przypadek 2: Jak mog\u0119 przeprowadzi\u0107 dok\u0142adn\u0105 kwantyfikacj\u0119 pomimo zanieczyszczenia pr\u00f3bki?<\/strong><\/p>\n\n<p>Opr\u00f3cz oznaczania ilo\u015bciowego kwas\u00f3w nukleinowych przy 260 nm, spektrofotometria UV-Vis oferuje opcj\u0119 okre\u015blania czysto\u015bci pr\u00f3bki poprzez zastosowanie dodatkowych d\u0142ugo\u015bci fal (odpowiednio 230 nm, 280 nm, 320 nm) lub skanowania d\u0142ugo\u015bci fal. Analiza danych pozwoli na wyci\u0105gni\u0119cie wniosk\u00f3w dotycz\u0105cych obecno\u015bci substancji takich jak s\u00f3l, bia\u0142ka czy cz\u0105stki sta\u0142e. Je\u015bli, z drugiej strony, widma absorbancji s\u0105 zbyt podobne, jak w przypadku r\u00f3\u017cnych kwas\u00f3w nukleinowych, sama absorbancja nie b\u0119dzie w stanie odr\u00f3\u017cni\u0107 na przyk\u0142ad RNA od DNA. W takim przypadku pomiary fluorescencji pozwol\u0105 na specyficzn\u0105 kwantyfikacj\u0119 analit\u00f3w bez ingerencji innych cz\u0105steczek.<\/p>\n\n<p><strong>Na jakiej zasadzie opiera si\u0119 ta metoda?<\/strong><\/p>\n\n<p>Pomiary fluorescencji wykorzystuj\u0105 zjawisko, \u017ce pewne cz\u0105steczki s\u0105 zdolne do emitowania energii w postaci \u015bwiat\u0142a. Do wykrywania biocz\u0105steczek, takich jak kwasy nukleinowe i bia\u0142ka, wybiera si\u0119 barwnik fluorescencyjny, kt\u00f3ry b\u0119dzie wi\u0105za\u0142 si\u0119 z analitem z najwy\u017csz\u0105 mo\u017cliw\u0105 specyficzno\u015bci\u0105. Klasycznym przyk\u0142adem jest wi\u0105zanie odczynnika PicoGreen <sup>\u00ae<\/sup> z dsDNA. Po wzbudzeniu kompleksu \u015bwiat\u0142em o okre\u015blonej d\u0142ugo\u015bci fali (oko\u0142o 480 nm dla PicoGreen), fluorofor b\u0119dzie emitowa\u0142 \u015bwiat\u0142o o ni\u017cszej energii, tj. o wi\u0119kszej d\u0142ugo\u015bci fali (oko\u0142o 520 nm dla PicoGreen) (rysunek 1). \u015awiat\u0142o jest mierzone jako fluorescencja wzgl\u0119dna (RFU), gdzie intensywno\u015b\u0107 fluorescencji jest proporcjonalna do st\u0119\u017cenia pr\u00f3bki.<\/p>\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><img loading=\"lazy\" width=\"768\" height=\"247\" src=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-9671\" srcset=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg 768w, https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left-600x193.jpg 600w\" sizes=\"(max-width: 768px) 100vw, 768px\" \/><figcaption>Rysunek 1:<br\/>A) Zasada pomiaru fluorescencji kwas\u00f3w nukleinowych (po lewej)<br\/>B) \u015awiat\u0142o wykorzystywane do wzbudzenia fluoroforu (EX) ma kr\u00f3tsz\u0105 d\u0142ugo\u015b\u0107 fali ni\u017c \u015bwiat\u0142o emitowane (EM) (po prawej)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n<p><strong>Jakie materia\u0142y s\u0105 wymagane do tej metody?<\/strong><\/p>\n\n<p>Ocena ilo\u015bciowa kwas\u00f3w nukleinowych i bia\u0142ek korzysta z wyboru barwnik\u00f3w fluorescencyjnych, kt\u00f3re wi\u0105\u017c\u0105 si\u0119 z odpowiedni\u0105 cz\u0105steczk\u0105 docelow\u0105 z wysok\u0105 specyficzno\u015bci\u0105. Ponadto musi by\u0107 dost\u0119pny co najmniej jeden wzorzec o znanym st\u0119\u017ceniu. Wzbudzenie fluoroforu i pomiar intensywno\u015bci fluorescencji emitowanego \u015bwiat\u0142a wymagaj\u0105 samodzielnego fluorometru lub modu\u0142u fluorescencyjnego zintegrowanego z innym przyrz\u0105dem. Sprz\u0119t i barwnik fluorescencyjny musz\u0105 by\u0107 kompatybilne, aby \u017ar\u00f3d\u0142o \u015bwiat\u0142a wewn\u0105trz przyrz\u0105du zapewnia\u0142o wymagan\u0105 d\u0142ugo\u015b\u0107 fali wzbudzenia, a detektor mierzy\u0142 emitowane \u015bwiat\u0142o. W zale\u017cno\u015bci od typu aparatu roztwory odczynnik\u00f3w s\u0105 umieszczane w cienko\u015bciennych naczyniach reakcyjnych lub w kuwetach. Nale\u017cy wzi\u0105\u0107 pod uwag\u0119 zgodno\u015b\u0107 z konkretnym zastosowaniem pod wzgl\u0119dem dopasowania, przezroczysto\u015bci, autofluorescencji i obj\u0119to\u015bci.<\/p>\n\n<p><strong>Jak przebiega metoda?<\/strong><\/p>\n\n<p>Rysunek 2 przedstawia sekwencj\u0119 pomiaru fluorymetrycznego. Przygotowanie \u015blepej pr\u00f3by, wzorc\u00f3w i pr\u00f3bki rozpoczyna si\u0119 od dodania barwnika fluorescencyjnego, po czym nast\u0119puje kr\u00f3tki okres inkubacji. Najpierw mierzy si\u0119 jeden lub wi\u0119cej standard\u00f3w o znanych st\u0119\u017ceniach w celu wygenerowania krzywej standardowej. Oznaczenie st\u0119\u017cenia pr\u00f3bki nast\u0119puje nast\u0119pnie w drugim etapie, w kt\u00f3rym zmierzone nat\u0119\u017cenia fluorescencji pr\u00f3bek s\u0105 oceniane w odniesieniu do krzywej standardowej.<\/p>\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><img loading=\"lazy\" width=\"768\" height=\"486\" src=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-9676\" srcset=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg 768w, https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence-632x400.jpg 632w, https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence-600x380.jpg 600w\" sizes=\"(max-width: 768px) 100vw, 768px\" \/><figcaption>Fluorescencja przep\u0142ywu pracy<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n<p><strong>Fluorescencja \u2013 metoda z wyboru?<\/strong><\/p>\n\n<p>Nawet je\u015bli fluorometria oferuje zalety w niekt\u00f3rych przypadkach, klasyczna spektrofotometria UV-Vis nadal jest standardow\u0105 metod\u0105, je\u015bli chodzi o ilo\u015bciowe oznaczanie kwas\u00f3w nukleinowych i bia\u0142ek. Spektrofotometria umo\u017cliwia weryfikacj\u0119 czysto\u015bci pr\u00f3bki, a wysoko st\u0119\u017cone roztwory mog\u0105 by\u0107 analizowane bezpo\u015brednio. W zale\u017cno\u015bci od jako\u015bci pr\u00f3bki, a tak\u017ce wymaga\u0144 dalszych aplikacji, mo\u017ce by\u0107 wskazane po\u0142\u0105czenie obu technik. <\/p>\n\n<p><br\/><em><sup>PicoGreen\u00ae<\/sup> jest zastrze\u017conym znakiem towarowym Molecular Probes, Inc. Korporacja, Eugene, OR, USA. Eppendorf <sup>\u00ae<\/sup> , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer <sup>\u00ae<\/sup> , Uvette <sup>\u00ae<\/sup> i Eppendorf \u00b5Cuvette <sup>\u00ae<\/sup> s\u0105 zastrze\u017conymi znakami towarowymi Eppendorf AG, Niemcy. Wszelkie prawa zastrze\u017cone, w tym grafika i obrazy. Prawa autorskie \u00a9 2019 Eppendorf AG.<\/em><\/p>\n\n<p><a href=\"http:\/\/handling-solutions.eppendorf.com\">\u0179r\u00f3d\u0142o<\/a><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Kwantyfikacja kwas\u00f3w nukleinowych i bia\u0142ek jest rutynowo przeprowadzana przy u\u017cyciu spektrofotometrii UV-Vis; jednak czasami wykrywanie za pomoc\u0105 fluorescencji mo\u017ce okaza\u0107 si\u0119 bardziej korzystne. W tym przypadku cz\u0105steczki nie s\u0105 wykrywane przez absorbancj\u0119, ale s\u0105 wykrywane w spos\u00f3b po\u015bredni \u2013 poprzez sygna\u0142 barwnika fluorescencyjnego. Fluorescencja nie tylko oferuje bardzo czu\u0142\u0105 metod\u0119 wykrywania, ale umo\u017cliwia selektywny pomiar [&#8230;]\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[496],"tags":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9959"}],"collection":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=9959"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9959\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":9968,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9959\/revisions\/9968"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=9959"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=9959"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=9959"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}