{"id":9837,"date":"2022-02-28T11:25:57","date_gmt":"2022-02-28T11:25:57","guid":{"rendered":"https:\/\/cotslab.com\/spektrofotometria-uv-vis-latwa-i-szybka-ocena-ilosciowa-kwasow-nukleinowych\/"},"modified":"2022-02-28T11:25:58","modified_gmt":"2022-02-28T11:25:58","slug":"spektrofotometria-uv-vis-latwa-i-szybka-ocena-ilosciowa-kwasow-nukleinowych","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/spektrofotometria-uv-vis-latwa-i-szybka-ocena-ilosciowa-kwasow-nukleinowych\/","title":{"rendered":"Spektrofotometria UV-Vis \u2013 \u0142atwa i szybka ocena ilo\u015bciowa kwas\u00f3w nukleinowych"},"content":{"rendered":"\n<p>Pomiar absorbancji roztworu kwasu nukleinowego przy zaledwie czterech d\u0142ugo\u015bciach fali wystarcza do okre\u015blenia jego st\u0119\u017cenia i uzyskania wgl\u0105du w jego czysto\u015b\u0107.<\/p>\n\n<p><em>\u0179r\u00f3d\u0142o obrazu: Drogatnev\/shutterstock.com<\/em><\/p>\n\n<p>Kwasy nukleinowe s\u0105 izolowane z materia\u0142u pr\u00f3bki, takiego jak kom\u00f3rki, a nast\u0119pnie wykorzystywane w dalszych eksperymentach laboratoryjnych. W tym celu wskazane jest okre\u015blenie st\u0119\u017cenia oczyszczonego DNA lub RNA oraz weryfikacja ich czysto\u015bci. W ten spos\u00f3b dok\u0142adnie okre\u015blone ilo\u015bci kwasu nukleinowego wejd\u0105 do dalszych aplikacji, a wszelkie zanieczyszczenia, kt\u00f3re mog\u0105 mie\u0107 wp\u0142yw na czu\u0142\u0105 reakcj\u0119 lub oznaczenie, b\u0119d\u0105 wykrywane w czasie rzeczywistym.<\/p>\n\n<p>Spektrofotometria UV-Vis jest \u0142atw\u0105, szybk\u0105 i sprawdzon\u0105 metod\u0105 pozwalaj\u0105c\u0105 na osi\u0105gni\u0119cie tych cel\u00f3w. W zakresie 260 nm kwasy nukleinowe wykazuj\u0105 charakterystyczny pik absorbancji (rysunek 1). Ta warto\u015b\u0107 absorbancji jest zatem wykorzystywana do obliczania st\u0119\u017ce\u0144 kwas\u00f3w nukleinowych. Zgodnie z prawem Lamberta-Beera do obliczenia st\u0119\u017cenia pr\u00f3bki wymagane s\u0105 dwa parametry: d\u0142ugo\u015b\u0107 drogi optycznej (= d\u0142ugo\u015b\u0107 drogi \u015bwietlnej (L)) oraz molowy wsp\u00f3\u0142czynnik ekstynkcji (sta\u0142a w\u0142a\u015bciwa dla materia\u0142u i d\u0142ugo\u015bci fali) pr\u00f3bka do pomiaru. Konkretny wsp\u00f3\u0142czynnik (F) mo\u017cna obliczy\u0107 przy u\u017cyciu standardowej kuwety o drodze \u015bwiat\u0142a 1 cm. Wsp\u00f3\u0142czynnik ten jest nast\u0119pnie mno\u017cony przez zmierzon\u0105 warto\u015b\u0107 absorbancji (A) w celu uzyskania st\u0119\u017cenia (C) roztworu pr\u00f3bki. W literaturze zazwyczaj dost\u0119pne s\u0105 odpowiednio molowe wsp\u00f3\u0142czynniki ekstynkcji i specyficzne czynniki. Przyk\u0142adowo wsp\u00f3\u0142czynnik dsDNA wynosi 50 \u00b5g\/ml (RNA: 40 \u00b5g\/ml) i jest z definicji r\u00f3wnowa\u017cny jednej jednostce absorbancji. te dane.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-table\"><table><tbody><tr><td><strong>Prawo Lamberta-Beera:<\/strong><br\/><br\/> <strong>C = A\/(L x \u0190 )<\/strong><br\/> <strong>F = 1\/\u0190<\/strong> (dla drogi \u015bwiat\u0142a 1 cm)<br\/><br\/>  <strong> &#8211; C = A x F<\/strong><\/td><td> C = st\u0119\u017cenie<br\/> A = Absorbancja<br\/> L = D\u0142ugo\u015b\u0107 drogi optycznej (\u015bwiat\u0142a)<br\/> \u0190 = molowy wsp\u00f3\u0142czynnik ekstynkcji<br\/> (w zale\u017cno\u015bci od pr\u00f3bki i d\u0142ugo\u015bci fali)<br\/> F = wsp\u00f3\u0142czynnik<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><img loading=\"lazy\" width=\"768\" height=\"456\" src=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-9633\" srcset=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg 768w, https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6-674x400.jpg 674w, https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6-600x356.jpg 600w\" sizes=\"(max-width: 768px) 100vw, 768px\" \/><figcaption>Rysunek 1: Widmo absorbancji kwas\u00f3w nukleinowych przy odpowiednich d\u0142ugo\u015bciach fal oraz przyk\u0142ad opisuj\u0105cy obliczenie st\u0119\u017cenia pr\u00f3bki dsDNA.<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n<p>Aby m\u00f3c wyda\u0107 o\u015bwiadczenie o czysto\u015bci pr\u00f3bki kwasu nukleinowego, nale\u017cy okre\u015bli\u0107 absorbancj\u0119 przy d\u0142ugo\u015bci fali innej ni\u017c 260 nm (rysunek 1). Ilorazy pochodz\u0105ce z warto\u015bci absorbancji mierzonej przy 260 nm, 280 nm i 230 nm (A <sub>260<\/sub> \/A <sub>280<\/sub> i A <sub>260<\/sub> \/A <sub>230<\/sub> ) stanowi\u0105 wsp\u00f3\u0142czynniki czysto\u015bci, kt\u00f3re pomagaj\u0105 zidentyfikowa\u0107 ewentualne zanieczyszczenia. Zanieczyszczenia, takie jak bia\u0142ka i \u015blady odczynnik\u00f3w, kt\u00f3re zosta\u0142y u\u017cyte podczas procesu oczyszczania, daj\u0105 inne widmo absorbancji ni\u017c kwasy nukleinowe, a tym samym wp\u0142ywaj\u0105 na wsp\u00f3\u0142czynniki czysto\u015bci (rysunek 2). Stosunek <sub>A260<\/sub> \/ <sub>A280<\/sub> w czystych roztworach kwasu nukleinowego b\u0119dzie wynosi\u0142 oko\u0142o 1,8-2,0, podczas gdy stosunek <sub>A260<\/sub> \/ <sub>A230<\/sub> b\u0119dzie zazwyczaj wykazywa\u0142 warto\u015bci w zakresie 2,0-2,5.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" width=\"768\" height=\"445\" src=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_Two_Applications_389bfe613c.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-9638\" srcset=\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_Two_Applications_389bfe613c.jpg 768w, https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_Two_Applications_389bfe613c-690x400.jpg 690w, https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_Two_Applications_389bfe613c-600x348.jpg 600w\" sizes=\"(max-width: 768px) 100vw, 768px\" \/><figcaption>Rysunek 2: Widma absorbancji kwas\u00f3w nukleinowych i mo\u017cliwych zanieczyszcze\u0144<\/figcaption><\/figure>\n\n<p>Do okre\u015blenia t\u0142a wykorzystywana jest czwarta d\u0142ugo\u015b\u0107 fali. Mierzy si\u0119 j\u0105 przy d\u0142ugo\u015bci fali 320 nm lub powy\u017cej, poniewa\u017c ani kwasy nukleinowe, ani zanieczyszczenia organiczne nie absorbuj\u0105 \u015bwiat\u0142a przy tej d\u0142ugo\u015bci fali. Absorbancja mierzona w tym zakresie mo\u017ce wskazywa\u0107 na obecno\u015b\u0107 cz\u0105stek lub p\u0119cherzyk\u00f3w powietrza w pr\u00f3bce. Nawet rozmazana kuweta jest w stanie wywo\u0142a\u0107 odczyt w tle. Nowoczesne fotometry oferuj\u0105 opcj\u0119 aktywacji funkcji korekcji t\u0142a, kt\u00f3ra spowoduje automatyczne odj\u0119cie absorbancji t\u0142a od wszystkich innych warto\u015bci mierzonych.<\/p>\n\n<p>Ponadto mo\u017cna wychwyci\u0107 pe\u0142ne widmo pr\u00f3bki kwasu nukleinowego (zwykle mi\u0119dzy 220 a 320 nm). Por\u00f3wnanie z widmem uzyskanym z czystego roztworu kwasu nukleinowego pozwoli na wykrycie ewentualnych b\u0142\u0119d\u00f3w podczas procesu pomiarowego, a tak\u017ce obecno\u015b\u0107 zanieczyszcze\u0144 w pr\u00f3bce.<\/p>\n\n<p><a href=\"http:\/\/handling-solutions.eppendorf.com\/\">\u0179r\u00f3d\u0142o<\/a><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Pomiar absorbancji roztworu kwasu nukleinowego przy zaledwie czterech d\u0142ugo\u015bciach fali wystarcza do okre\u015blenia jego st\u0119\u017cenia i uzyskania wgl\u0105du w jego czysto\u015b\u0107. \u0179r\u00f3d\u0142o obrazu: Drogatnev\/shutterstock.com Kwasy nukleinowe s\u0105 izolowane z materia\u0142u pr\u00f3bki, takiego jak kom\u00f3rki, a nast\u0119pnie wykorzystywane w dalszych eksperymentach laboratoryjnych. W tym celu wskazane jest okre\u015blenie st\u0119\u017cenia oczyszczonego DNA lub RNA oraz weryfikacja ich [&#8230;]\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[496],"tags":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9837"}],"collection":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=9837"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9837\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":9843,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9837\/revisions\/9843"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=9837"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=9837"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=9837"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}