{"id":9946,"date":"2022-02-28T12:10:56","date_gmt":"2022-02-28T12:10:56","guid":{"rendered":"https:\/\/cotslab.com\/fluorescens-et-verdifullt-tillegg-til-absorbansen\/"},"modified":"2022-02-28T12:11:00","modified_gmt":"2022-02-28T12:11:00","slug":"fluorescens-et-verdifullt-tillegg-til-absorbansen","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cotslab.com\/no\/fluorescens-et-verdifullt-tillegg-til-absorbansen\/","title":{"rendered":"Fluorescens: Et verdifullt tillegg til absorbansen?"},"content":{"rendered":"\n

Kvantifisering av nukleinsyrer og proteiner utf\u00f8res rutinemessig ved bruk av UV-Vis spektrofotometri; Imidlertid kan p\u00e5visning via fluorescens av og til vise seg \u00e5 v\u00e6re mer fordelaktig. I dette tilfellet oppdages ikke molekyler gjennom absorbans, men de oppdages p\u00e5 en indirekte m\u00e5te – via signalet til et fluorescerende fargestoff. Ikke bare tilbyr fluorescens en sv\u00e6rt sensitiv deteksjonsmetode, men den tillater selektiv m\u00e5ling av individuelle analytter.<\/p>\n\n

Tilfelle 1: Hvordan g\u00e5r jeg frem med lavkonsentrasjonspr\u00f8vel\u00f8sninger?<\/strong><\/p>\n\n

UV-Vis spektrofotometri er lite sensitiv \u2013 for \u00e5 f\u00e5 n\u00f8yaktige og presise data b\u00f8r pr\u00f8vekonsentrasjoner derfor ikke tillates \u00e5 falle under en viss konsentrasjonsterskel. For dsDNA er denne nedre grensen omtrent 1 \u00b5g\/ml. Selv om den nedre grensen for deteksjon av fotometeret ikke er n\u00e5dd, er virkningen av m\u00e5lingsun\u00f8yaktighet i dette omr\u00e5det betydelig, og resulterende verdier kan v\u00e6re utsatt for betydelig variasjon. Fluorometrisk analyse, som er 1000 ganger mer f\u00f8lsom enn absorbansmetoden, er i stand til \u00e5 kvantifisere pr\u00f8vel\u00f8sninger med ekstremt lave konsentrasjoner sv\u00e6rt n\u00f8yaktig.<\/p>\n\n

Tilfelle 2: Hvordan kan jeg utf\u00f8re n\u00f8yaktig kvantifisering til tross for pr\u00f8vekontaminering?<\/strong><\/p>\n\n

I tillegg til kvantifisering av nukleinsyrer ved 260 nm, tilbyr UV-Vis spektrofotometri muligheten for \u00e5 bestemme pr\u00f8verenheten ved \u00e5 bruke ytterligere b\u00f8lgelengder (henholdsvis 230 nm, 280 nm, 320 nm), eller en b\u00f8lgelengdeskanning. Dataanalyse vil tillate konklusjoner ang\u00e5ende tilstedev\u00e6relsen av stoffer som salt, proteiner eller faste partikler. Dersom absorbansspektrene derimot er for like, slik tilfellet er for de ulike nukleinsyrene, vil ikke absorbansen alene kunne skille mellom for eksempel RNA og DNA. I dette tilfellet vil fluorescensm\u00e5linger tillate spesifikk kvantifisering av analytter, uten interferens fra andre molekyler.<\/p>\n\n

Hvilket prinsipp er denne metoden basert p\u00e5?<\/strong><\/p>\n\n

Fluorescensm\u00e5linger drar nytte av fenomenet at visse molekyler er i stand til \u00e5 sende ut energi i form av lys. For p\u00e5visning av biomolekyler som nukleinsyrer og proteiner velges et fluorescerende fargestoff som vil binde seg til analytten med h\u00f8yest mulig spesifisitet. Bindingen av reagenset PicoGreen \u00ae<\/sup> til dsDNA er et klassisk eksempel. Etter eksitering av komplekset ved bruk av lys med en spesifikk b\u00f8lgelengde (ca. 480 nm for PicoGreen), vil fluoroforen sende ut lys med lavere energi, dvs. med lengre b\u00f8lgelengde (ca. 520 nm for PicoGreen) (figur 1). Lyset m\u00e5les som relativ fluorescens (RFU), hvor intensiteten av fluorescensen er proporsjonal med konsentrasjonen av pr\u00f8ven.<\/p>\n\n

\"\"
Figur 1:A) Prinsipp for fluorescensm\u00e5linger av nukleinsyrer (til venstre)B) Lyset som brukes til \u00e5 eksitere fluoroforen (EX) har en kortere b\u00f8lgelengde enn det utsendte lyset (EM) (h\u00f8yre)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n

Hvilke materialer kreves for denne metoden?<\/strong><\/p>\n\n

Kvantifisering av nukleinsyrer og proteiner drar nytte av utvalget av fluorescerende fargestoffer som binder seg til deres respektive m\u00e5lmolekyler med h\u00f8y spesifisitet. I tillegg m\u00e5 minst \u00e9n standard med kjent konsentrasjon v\u00e6re tilgjengelig. Eksitering av fluoroforen og m\u00e5ling av fluorescensintensiteten til det utsendte lyset krever enten et frittst\u00e5ende fluorometer eller en fluorescensmodul som er integrert i et annet instrument. Utstyr og fluorescerende fargestoff m\u00e5 v\u00e6re kompatible slik at lyskilden inne i instrumentet gir den n\u00f8dvendige eksitasjonsb\u00f8lgelengden(e) og detektoren m\u00e5ler lyset som sendes ut. Avhengig av type instrument er reagensl\u00f8sningene plassert enten i tynnveggede reaksjonsbeholdere eller i kyvetter. Kompatibilitet med den spesifikke applikasjonen med hensyn til passform, transparens, autofluorescens og volum m\u00e5 tas i betraktning.<\/p>\n\n

Hvordan utf\u00f8res metoden?<\/strong><\/p>\n\n

Figur 2 viser sekvensen av en fluorometrisk m\u00e5ling. Forberedelse av blindpr\u00f8ven, standardene og pr\u00f8ven initieres ved tilsetning av det fluorescerende fargestoffet, etterfulgt av en kort inkubasjonsperiode. F\u00f8rst m\u00e5les en eller flere standarder med kjente konsentrasjoner for \u00e5 generere standardkurven. Bestemmelse av pr\u00f8vekonsentrasjon skjer deretter i et andre trinn, hvor de m\u00e5lte fluorescensintensitetene til pr\u00f8vene vurderes i forhold til standardkurven.<\/p>\n\n

\"\"
Workflow fluorescens<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n

Fluorescens \u2013 valgmetode?<\/strong><\/p>\n\n

Selv om fluorometri gir fordeler i visse tilfeller, fortsetter klassisk UV-Vis-spektrofotometri \u00e5 v\u00e6re standardmetoden n\u00e5r det gjelder kvantifisering av nukleinsyrer og proteiner. Spektrofotometri tillater verifisering av pr\u00f8verenhet, og h\u00f8yt konsentrerte l\u00f8sninger kan analyseres direkte. Avhengig av kvaliteten p\u00e5 pr\u00f8ven, samt kravene til nedstr\u00f8msapplikasjoner, kan det v\u00e6re lurt \u00e5 kombinere begge teknikkene. <\/p>\n\n

PicoGreen \u00ae<\/sup> er et registrert varemerke for Molecular Probes, Inc. Corporation, Eugene, OR, USA. Eppendorf \u00ae<\/sup> , Eppendorf Brand Design, Eppendorf BioSpectrometer \u00ae<\/sup> , Uvette \u00ae<\/sup> og Eppendorf \u00b5Cuvette \u00ae<\/sup> er registrerte varemerker for Eppendorf AG, Tyskland. Alle rettigheter forbeholdt, inkludert grafikk og bilder. Copyright \u00a9 2019 Eppendorf AG.<\/em><\/p>\n\n

Kilde<\/a><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Kvantifisering av nukleinsyrer og proteiner utf\u00f8res rutinemessig ved bruk av UV-Vis spektrofotometri; Imidlertid kan p\u00e5visning via fluorescens av og til vise seg \u00e5 v\u00e6re mer fordelaktig. I dette tilfellet oppdages ikke molekyler gjennom absorbans, men de oppdages p\u00e5 en indirekte m\u00e5te – via signalet til et fluorescerende fargestoff. Ikke bare tilbyr fluorescens en sv\u00e6rt sensitiv […]\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[494],"tags":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9946"}],"collection":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=9946"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9946\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":9956,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9946\/revisions\/9956"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=9946"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=9946"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=9946"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}