{"id":9824,"date":"2022-02-28T11:25:56","date_gmt":"2022-02-28T11:25:56","guid":{"rendered":"https:\/\/cotslab.com\/uv-vis-spektrofotometri-enkel-og-rask-kvantifisering-av-nukleinsyrer\/"},"modified":"2022-02-28T11:25:58","modified_gmt":"2022-02-28T11:25:58","slug":"uv-vis-spektrofotometri-enkel-og-rask-kvantifisering-av-nukleinsyrer","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cotslab.com\/no\/uv-vis-spektrofotometri-enkel-og-rask-kvantifisering-av-nukleinsyrer\/","title":{"rendered":"UV-Vis spektrofotometri \u2013 Enkel og rask kvantifisering av nukleinsyrer"},"content":{"rendered":"\n

Absorbansm\u00e5lingen av en nukleinsyrel\u00f8sning ved bare fire b\u00f8lgelengder er tilstrekkelig til \u00e5 bestemme dens konsentrasjon og for \u00e5 f\u00e5 innsikt i dens renhet.<\/p>\n\n

Bildekilde: DRogatnev\/shutterstock.com<\/em><\/p>\n\n

Nukleinsyrer isoleres fra pr\u00f8vemateriale som celler og brukes deretter i ytterligere laboratorieeksperimenter. For dette form\u00e5let er det tilr\u00e5delig \u00e5 bestemme konsentrasjonen av renset DNA eller RNA samt verifisere deres renhet. P\u00e5 denne m\u00e5ten vil n\u00f8yaktig definerte mengder av nukleinsyren g\u00e5 inn i nedstr\u00f8msapplikasjonen, og enhver forurensning som kan p\u00e5virke en sensitiv reaksjon eller analyse blir oppdaget i sanntid.<\/p>\n\n

UV-Vis spektrofotometri er en enkel, rask og tidstestet metode for \u00e5 n\u00e5 disse m\u00e5lene. I omr\u00e5det 260 nm viser nukleinsyrer en karakteristisk absorbanstopp (figur 1). Denne absorbansverdien brukes derfor til \u00e5 beregne nukleinsyrekonsentrasjoner. I henhold til Lambert-Beer-loven kreves det to parametere for \u00e5 beregne konsentrasjonen av en pr\u00f8ve: den optiske veilengden (= lysbanelengden (L)) og den molare ekstinksjonskoeffisienten (materiale- og b\u00f8lgelengdespesifikk konstant) til pr\u00f8ve som skal m\u00e5les. Den spesifikke faktoren (F) kan beregnes ved bruk av en standard kyvette med en lysbane p\u00e5 1 cm. Denne faktoren multipliseres deretter med den m\u00e5lte absorbansverdien (A) for \u00e5 komme frem til konsentrasjonen (C) av pr\u00f8vel\u00f8sningen. Molare ekstinksjonskoeffisienter og spesifikke faktorer er typisk tilgjengelig i litteraturen. Faktoren for dsDNA er for eksempel 50 \u00b5g\/mL (RNA: 40 \u00b5g\/ml), og det tilsvarer per definisjon \u00e9n absorbansenhet. disse dataene.<\/p>\n\n

Lambert-Beer lov:<\/strong> C = A\/(L x \u0190 )<\/strong> F = 1\/\u0190<\/strong> (for en lysbane p\u00e5 1 cm) – C = A x F<\/strong><\/td> C = Konsentrasjon A = Absorbans L = Optisk (lys) banelengde \u0190 = Molar ekstinksjonskoeffisient (pr\u00f8ve- og b\u00f8lgelengdespesifikk) F = Faktor<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n
\"\"
Figur 1: Absorbansspektrum av nukleinsyrer med relevante b\u00f8lgelengder og et eksempel som beskriver beregningen av konsentrasjonen til en dsDNA-pr\u00f8ve.<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n

For \u00e5 kunne uttale seg om renheten til en nukleinsyrepr\u00f8ve, m\u00e5 absorbansen ved andre b\u00f8lgelengder enn 260 nm bestemmes (figur 1). Kvotene avledet fra absorbansverdiene m\u00e5lt ved 260<\/sub> nm, 280<\/sub> nm og 230<\/sub> nm (A260\/A280 og A260<\/sub> \/A230) utgj\u00f8r renhetsforholdene som hjelper til med \u00e5 identifisere mulige forurensninger. Urenheter som proteiner og spor av reagenser som ble brukt under renseprosessen gir et annet absorbansspektrum enn nukleinsyrene og p\u00e5virker dermed renhetsforholdene (figur 2). A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> -forholdet for rene nukleinsyrel\u00f8sninger vil v\u00e6re omtrent 1,8 \u2013 2,0, mens forholdet A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> typisk vil vise verdier i omr\u00e5det 2,0 \u2013 2,5.<\/p>\n\n

\"\"
Figur 2: Absorbansspektra for nukleinsyrer og mulige forurensninger<\/figcaption><\/figure>\n\n

En fjerde b\u00f8lgelengde brukes til \u00e5 bestemme bakgrunnen. Den m\u00e5les ved eller over 320 nm da verken nukleinsyrer eller organiske forurensninger absorberer lys ved denne b\u00f8lgelengden. Absorbans m\u00e5lt i dette omr\u00e5det kan indikere tilstedev\u00e6relsen av partikler eller luftbobler i pr\u00f8ven. Selv en flekkete kyvette er i stand til \u00e5 fremkalle en bakgrunnslesing. Moderne fotometre tilbyr muligheten til \u00e5 aktivere en bakgrunnskorreksjonsfunksjon som vil bevirke automatisk subtraksjon av eventuell bakgrunnsabsorbans fra alle andre m\u00e5lte verdier.<\/p>\n\n

I tillegg kan hele spekteret til en nukleinsyrepr\u00f8ve fanges opp (typisk mellom 220 og 320 nm). Sammenligninger med spekteret oppn\u00e5dd fra en ren nukleinsyrel\u00f8sning vil muliggj\u00f8re p\u00e5visning av mulige feil under m\u00e5leprosessen samt tilstedev\u00e6relsen av forurensninger i pr\u00f8ven.<\/p>\n\n

Kilde<\/a><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Absorbansm\u00e5lingen av en nukleinsyrel\u00f8sning ved bare fire b\u00f8lgelengder er tilstrekkelig til \u00e5 bestemme dens konsentrasjon og for \u00e5 f\u00e5 innsikt i dens renhet. Bildekilde: DRogatnev\/shutterstock.com Nukleinsyrer isoleres fra pr\u00f8vemateriale som celler og brukes deretter i ytterligere laboratorieeksperimenter. For dette form\u00e5let er det tilr\u00e5delig \u00e5 bestemme konsentrasjonen av renset DNA eller RNA samt verifisere deres renhet. […]\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[494],"tags":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9824"}],"collection":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=9824"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9824\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":9836,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9824\/revisions\/9836"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=9824"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=9824"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/no\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=9824"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}