Nucle\u00efnezuren worden ge\u00efsoleerd uit monstermateriaal zoals cellen en vervolgens gebruikt in verdere laboratoriumexperimenten. Voor dit doel is het raadzaam om de concentratie van het gezuiverde DNA of RNA te bepalen en de zuiverheid ervan te verifi\u00ebren. Op deze manier komen nauwkeurig gedefinieerde hoeveelheden van het nucle\u00efnezuur de stroomafwaartse toepassing binnen en worden eventuele verontreinigingen die een gevoelige reactie of test kunnen be\u00efnvloeden, in realtime gedetecteerd.<\/p>\n\n
UV-Vis-spectrofotometrie is een gemakkelijke, snelle en beproefde methode om deze doelstellingen te bereiken. In het bereik van 260 nm vertonen nucle\u00efnezuren een karakteristieke absorptiepiek (figuur 1). Deze absorptiewaarde wordt daarom gebruikt om nucle\u00efnezuurconcentraties te berekenen. Volgens de wet van Lambert-Beer zijn twee parameters vereist voor de berekening van de concentratie van een monster: de optische weglengte (= lichtweglengte (L)) en de molaire extinctieco\u00ebffici\u00ebnt (materiaal- en golflengtespecifieke constante) van de monster te meten. De specifieke factor (F) kan worden berekend bij gebruik van een standaard kuvet met een lichtpad van 1 cm. Deze factor wordt vervolgens vermenigvuldigd met de gemeten absorptiewaarde (A) om te komen tot de concentratie (C) van de monsteroplossing. Molaire extinctieco\u00ebffici\u00ebnten en specifieke factoren zijn typisch beschikbaar in de literatuur. De factor voor dsDNA is bijvoorbeeld 50 \u00b5g\/mL (RNA: 40 \u00b5g\/mL) en is per definitie gelijk aan \u00e9\u00e9n absorptie-eenheid. deze data.<\/p>\n\n Om een uitspraak te kunnen doen over de zuiverheid van een nucle\u00efnezuurmonster, moet de absorptie bij andere golflengten dan 260 nm worden bepaald (figuur 1). De quoti\u00ebnten afgeleid van de absorptiewaarden gemeten bij 260 nm, 280 nm en 230 nm ( A260<\/sub> \/ A280<\/sub> en A260<\/sub> \/ A230<\/sub> ) vormen de zuiverheidsverhoudingen die helpen bij het identificeren van mogelijke verontreinigingen. Onzuiverheden zoals eiwitten en sporen van reagentia die tijdens het zuiveringsproces zijn gebruikt, geven een ander absorptiespectrum dan dat van nucle\u00efnezuren en be\u00efnvloeden zo de zuiverheidsverhoudingen (figuur 2). De verhouding A260<\/sub> \/ A280<\/sub> van zuivere nucle\u00efnezuuroplossingen zal ongeveer 1,8-2,0 zijn, terwijl de verhouding A260<\/sub> \/A230 typisch waarden in het bereik van 2,0-2,5<\/sub> zal vertonen.<\/p>\n\n Een vierde golflengte wordt gebruikt om de achtergrond te bepalen. Het wordt gemeten bij of boven 320 nm, aangezien noch nucle\u00efnezuren noch organische verontreinigingen licht absorberen bij deze golflengte. Absorptie gemeten in dit bereik kan wijzen op de aanwezigheid van deeltjes of luchtbellen in het monster. Zelfs een besmeurde cuvet kan een achtergrondaflezing opwekken. Moderne fotometers bieden de mogelijkheid om een achtergrondcorrectiefunctie te activeren die ervoor zorgt dat eventuele achtergrondabsorptie automatisch wordt afgetrokken van alle andere meetwaarden.<\/p>\n\n Bovendien kan het volledige spectrum van een nucle\u00efnezuurmonster worden ingevangen (typisch tussen 220 en 320 nm). Vergelijkingen met het spectrum verkregen uit een zuivere nucle\u00efnezuuroplossing zullen de detectie van mogelijke fouten tijdens het meetproces en de aanwezigheid van verontreinigingen in het monster mogelijk maken.<\/p>\n\nLambert-Beer wet:<\/strong> C = Concentratie ![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_Two_Applications_389bfe613c.jpg\")