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단 4개의 파장에서 핵산 용액의 흡광도 측정은 농도를 결정하고 순도에 대한 통찰력을 얻기에 충분합니다.
이미지 출처: DRogatnev/shutterstock.com
핵산은 세포와 같은 샘플 물질에서 분리되고 이후에 추가 실험실 실험에 사용됩니다. 이를 위해 정제된 DNA 또는 RNA의 농도를 결정하고 순도를 확인하는 것이 좋습니다. 이러한 방식으로 정확하게 정의된 양의 핵산이 다운스트림 애플리케이션으로 들어가고 민감한 반응이나 분석에 영향을 미칠 수 있는 모든 오염이 실시간으로 감지됩니다.
UV-Vis 분광 광도계는 이러한 목표를 달성하기 위한 쉽고 빠르며 오랜 시간 동안 검증된 방법입니다. 260 nm 범위에서 핵산은 특징적인 흡광도 피크를 나타냅니다(그림 1). 따라서 이 흡광도 값은 핵산 농도를 계산하는 데 사용됩니다. Lambert-Beer 법칙에 따르면 시료의 농도 계산에는 두 가지 매개변수가 필요합니다. 측정할 샘플. 특정 계수(F)는 1cm의 광로를 가진 표준 큐벳을 사용할 때 계산할 수 있습니다. 그런 다음 이 계수에 측정된 흡광도 값(A)을 곱하여 시료 용액의 농도(C)에 도달합니다. 몰 흡광 계수 및 특정 인자는 각각 일반적으로 문헌에 나와 있습니다. 예를 들어 dsDNA의 인자는 50µg/mL(RNA: 40µg/mL)이며 정의상 하나의 흡광도 단위와 동일합니다. 이러한 데이터.
| Lambert-Beer 법칙: C = A/(L x Ɛ ) F = 1/Ɛ (광로 1cm의 경우) – C = A x F | C = 농도 A = 흡광도 L = 광학(광) 경로 길이 Ɛ = 몰 흡광 계수 (샘플 및 파장별) F = 계수 |
핵산 샘플의 순도를 설명하려면 260nm 이외의 파장에서 흡광도를 측정해야 합니다(그림 1). 260 nm, 280 nm 및 230 nm(A 260 /A 280 및 A 260 /A 230 )에서 측정된 흡광도 값에서 파생된 몫은 가능한 오염을 식별하는 데 도움이 되는 순도 비율을 구성합니다. 정제 과정에서 사용된 단백질 및 미량의 시약과 같은 불순물은 핵산의 흡광도 스펙트럼과 다른 흡광도 스펙트럼을 생성하므로 순도 비율에 영향을 미칩니다(그림 2). 순수한 핵산 용액의 A 260 /A 280 비율은 대략 1.8 – 2.0인 반면, 비율 A 260 /A 230 은 일반적으로 2.0 – 2.5 범위의 값을 나타냅니다.
네 번째 파장은 배경을 결정하는 데 사용됩니다. 핵산이나 유기 오염 물질이 이 파장에서 빛을 흡수하지 않기 때문에 320nm 이상에서 측정됩니다. 이 범위에서 측정된 흡광도는 샘플 내에 입자 또는 기포가 있음을 나타낼 수 있습니다. 얼룩진 큐벳도 배경 읽기를 유도할 수 있습니다. 최신 광도계는 다른 모든 측정값에서 배경 흡광도를 자동으로 빼는 배경 보정 기능을 활성화하는 옵션을 제공합니다.
또한, 핵산 샘플의 전체 스펙트럼이 캡처될 수 있습니다(일반적으로 220~320nm). 순수한 핵산 용액에서 얻은 스펙트럼과 비교하면 측정 과정에서 발생할 수 있는 오류와 샘플 내 오염 물질의 존재를 감지할 수 있습니다.
