La spettrofotometria UV-Vis non \u00e8 molto sensibile: per ottenere dati accurati e precisi, le concentrazioni del campione non dovrebbero quindi essere lasciate scendere al di sotto di una certa soglia di concentrazione. Per il dsDNA, questo limite inferiore \u00e8 di circa 1 \u00b5g\/mL. Anche se il limite inferiore di rilevamento del fotometro non \u00e8 stato raggiunto, l’impatto dell’imprecisione della misurazione in questo intervallo \u00e8 considerevole e i valori risultanti possono essere soggetti a variazioni sostanziali. L’analisi fluorometrica, essendo 1000 volte pi\u00f9 sensibile del metodo di assorbanza, \u00e8 in grado di quantificare in modo molto accurato soluzioni campione di concentrazioni estremamente basse.<\/p>\n\n
Caso 2: come posso eseguire una quantificazione accurata nonostante la contaminazione del campione?<\/strong><\/p>\n\n Oltre alla quantificazione degli acidi nucleici a 260 nm, la spettrofotometria UV-Vis offre la possibilit\u00e0 di determinare la purezza del campione utilizzando lunghezze d’onda aggiuntive (230 nm, 280 nm, 320 nm) o una scansione della lunghezza d’onda, rispettivamente. L’analisi dei dati consentir\u00e0 di trarre conclusioni sulla presenza di sostanze come sale, proteine o particelle solide. Se invece gli spettri di assorbanza sono troppo simili, come nel caso dei diversi acidi nucleici, l’assorbanza da sola non sar\u00e0 in grado di distinguere, ad esempio, tra RNA e DNA. In questo caso, le misure di fluorescenza consentiranno la quantificazione specifica degli analiti, senza interferenze da parte di altre molecole.<\/p>\n\n Su quale principio si basa questo metodo?<\/strong><\/p>\n\n Le misurazioni della fluorescenza sfruttano il fenomeno che alcune molecole sono in grado di emettere energia sotto forma di luce. Per il rilevamento di biomolecole come acidi nucleici e proteine, viene selezionato un colorante fluorescente che si legher\u00e0 all’analita con la massima specificit\u00e0 possibile. Il legame del reagente PicoGreen \u00ae<\/sup> al dsDNA \u00e8 un classico esempio. Dopo l’eccitazione del complesso utilizzando luce di una lunghezza d’onda specifica (circa 480 nm per PicoGreen), il fluoroforo emetter\u00e0 luce di energia inferiore, cio\u00e8 di lunghezza d’onda maggiore (circa 520 nm per PicoGreen) (figura 1). La luce viene misurata come fluorescenza relativa (RFU), dove l’intensit\u00e0 della fluorescenza \u00e8 proporzionale alla concentrazione del campione.<\/p>\n\n Quali materiali sono necessari per questo metodo?<\/strong><\/p>\n\n La quantificazione degli acidi nucleici e delle proteine trae vantaggio dalla selezione di coloranti fluorescenti che si legano alla rispettiva molecola bersaglio con elevata specificit\u00e0. Inoltre, deve essere disponibile almeno uno standard di concentrazione nota. L’eccitazione del fluoroforo e la misurazione dell’intensit\u00e0 di fluorescenza della luce emessa richiedono un fluorimetro autonomo o un modulo di fluorescenza integrato in un altro strumento. L’attrezzatura e il colorante fluorescente devono essere compatibili in modo che la sorgente luminosa all’interno dello strumento fornisca la\/e lunghezza\/e di eccitazione richiesta e il rivelatore misuri la luce emessa. A seconda del tipo di strumento, le soluzioni reagenti si trovano in recipienti di reazione a parete sottile o in cuvette. Deve essere presa in considerazione la compatibilit\u00e0 con l’applicazione specifica per quanto riguarda adattamento, trasparenza, autofluorescenza e volume.<\/p>\n\n Come viene eseguito il metodo?<\/strong><\/p>\n\n La figura 2 mostra la sequenza di una misurazione fluorimetrica. La preparazione del bianco, degli standard e del campione viene avviata mediante l’aggiunta del colorante fluorescente, seguita da un breve periodo di incubazione. In primo luogo, vengono misurati uno o pi\u00f9 standard di concentrazioni note per generare la curva standard. La determinazione della concentrazione del campione avviene successivamente in una seconda fase, in cui le intensit\u00e0 di fluorescenza misurate dei campioni vengono valutate in relazione alla curva standard.<\/p>\n\n Fluorescenza: metodo di scelta?<\/strong><\/p>\n\n Anche se la fluorometria offre vantaggi in alcuni casi, la classica spettrofotometria UV-Vis continua a essere il metodo standard quando si tratta di quantificazione di acidi nucleici e proteine. La spettrofotometria consente la verifica della purezza del campione e le soluzioni altamente concentrate possono essere analizzate direttamente. A seconda della qualit\u00e0 del campione, nonch\u00e9 dei requisiti delle applicazioni a valle, pu\u00f2 essere consigliabile combinare entrambe le tecniche. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg\")