Gli acidi nucleici vengono isolati dal materiale del campione come le cellule e successivamente impiegati in ulteriori esperimenti di laboratorio. A tale scopo, \u00e8 consigliabile determinare la concentrazione del DNA o RNA purificato e verificarne la purezza. In questo modo, quantit\u00e0 accuratamente definite dell’acido nucleico entreranno nell’applicazione a valle e tutte le contaminazioni che potrebbero influire su una reazione o un’analisi sensibili vengono rilevate in tempo reale.<\/p>\n\n
La spettrofotometria UV-Vis \u00e8 un metodo facile, rapido e testato nel tempo per raggiungere questi obiettivi. Nell’intervallo di 260 nm, gli acidi nucleici mostrano un caratteristico picco di assorbimento (figura 1). Questo valore di assorbanza viene quindi utilizzato per calcolare le concentrazioni di acido nucleico. Secondo la legge di Lambert-Beer, per il calcolo della concentrazione di un campione sono richiesti due parametri: la lunghezza del cammino ottico (= lunghezza del cammino ottico (L)) e il coefficiente di estinzione molare (materiale e costante specifica della lunghezza d’onda) del campione da misurare. Il fattore specifico (F) pu\u00f2 essere calcolato utilizzando una cuvetta standard con un percorso ottico di 1 cm. Questo fattore viene quindi moltiplicato per il valore di assorbanza misurato (A) per arrivare alla concentrazione (C) della soluzione campione. I coefficienti di estinzione molare e i fattori specifici, rispettivamente, sono tipicamente disponibili in letteratura. Il fattore per dsDNA, ad esempio, \u00e8 50 \u00b5g\/mL (RNA: 40 \u00b5g\/mL) ed \u00e8 per definizione equivalente a un’unit\u00e0 di assorbanza. questi dati.<\/p>\n\n Per poter fare una dichiarazione sulla purezza di un campione di acido nucleico, \u00e8 necessario determinare l’assorbanza a lunghezze d’onda diverse da 260 nm (figura 1). I quozienti derivati dai valori di assorbanza misurati a 260 nm, 280 nm e 230 nm (A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> e A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> ) costituiscono i rapporti di purezza che aiutano a identificare possibili contaminazioni. Impurit\u00e0 come proteine e tracce di reagenti che sono state utilizzate durante il processo di purificazione producono uno spettro di assorbimento diverso da quello degli acidi nucleici e quindi influenzano i rapporti di purezza (figura 2). Il rapporto A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> delle soluzioni di acido nucleico puro sar\u00e0 di circa 1,8 – 2,0, mentre il rapporto A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> mostrer\u00e0 tipicamente valori nell’intervallo 2,0 – 2,5.<\/p>\n\n Una quarta lunghezza d’onda viene utilizzata per determinare lo sfondo. Viene misurato pari o superiore a 320 nm poich\u00e9 n\u00e9 gli acidi nucleici n\u00e9 i contaminanti organici assorbono la luce a questa lunghezza d’onda. L’assorbanza misurata in questo intervallo pu\u00f2 indicare la presenza di particelle o bolle d’aria all’interno del campione. Anche una cuvetta macchiata \u00e8 in grado di suscitare una lettura di fondo. I fotometri moderni offrono la possibilit\u00e0 di attivare una funzione di correzione dello sfondo che effettuer\u00e0 la sottrazione automatica di qualsiasi assorbanza dello sfondo da tutti gli altri valori misurati.<\/p>\n\n Inoltre, pu\u00f2 essere catturato lo spettro completo di un campione di acido nucleico (tipicamente tra 220 e 320 nm). Il confronto con lo spettro ottenuto da una soluzione di acido nucleico puro consentir\u00e0 di rilevare possibili errori durante il processo di misurazione nonch\u00e9 la presenza di contaminanti all’interno del campione.<\/p>\n\nLegge Lambert-Birra:<\/strong> C = Concentrazione ![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\")
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