La spectrophotom\u00e9trie UV-Vis n’est pas tr\u00e8s sensible – afin d’obtenir des donn\u00e9es exactes et pr\u00e9cises, les concentrations des \u00e9chantillons ne doivent donc pas descendre en dessous d’un certain seuil de concentration. Pour l’ADNdb, cette limite inf\u00e9rieure est d’environ 1 \u00b5g\/mL. M\u00eame si la limite inf\u00e9rieure de d\u00e9tection du photom\u00e8tre n’a pas \u00e9t\u00e9 atteinte, l’impact de l’impr\u00e9cision de mesure dans cette plage est consid\u00e9rable et les valeurs r\u00e9sultantes peuvent \u00eatre sujettes \u00e0 des variations substantielles. L’analyse fluorom\u00e9trique, \u00e9tant 1000 fois plus sensible que la m\u00e9thode d’absorbance, est capable de quantifier tr\u00e8s pr\u00e9cis\u00e9ment des solutions d’\u00e9chantillons de concentrations extr\u00eamement faibles.<\/p>\n\n
Cas 2 : Comment puis-je effectuer une quantification pr\u00e9cise malgr\u00e9 la contamination de l’\u00e9chantillon ?<\/strong><\/p>\n\n En plus de la quantification des acides nucl\u00e9iques \u00e0 260 nm, la spectrophotom\u00e9trie UV-Vis offre la possibilit\u00e9 de d\u00e9terminer la puret\u00e9 de l’\u00e9chantillon en utilisant des longueurs d’onde suppl\u00e9mentaires (230 nm, 280 nm, 320 nm) ou un balayage de longueur d’onde, respectivement. L’analyse des donn\u00e9es permettra de tirer des conclusions sur la pr\u00e9sence de substances telles que le sel, les prot\u00e9ines ou les particules solides. Si, au contraire, les spectres d’absorbance sont trop similaires, comme c’est le cas pour les diff\u00e9rents acides nucl\u00e9iques, l’absorbance seule ne pourra pas faire la distinction entre, par exemple, l’ARN et l’ADN. Dans ce cas, les mesures de fluorescence permettront la quantification sp\u00e9cifique des analytes, sans interf\u00e9rence d’autres mol\u00e9cules.<\/p>\n\n Sur quel principe repose cette m\u00e9thode ?<\/strong><\/p>\n\n Les mesures de fluorescence tirent parti du ph\u00e9nom\u00e8ne selon lequel certaines mol\u00e9cules sont capables d’\u00e9mettre de l’\u00e9nergie sous forme de lumi\u00e8re. Pour la d\u00e9tection de biomol\u00e9cules telles que les acides nucl\u00e9iques et les prot\u00e9ines, un colorant fluorescent est s\u00e9lectionn\u00e9 qui se liera \u00e0 l’analyte avec la plus grande sp\u00e9cificit\u00e9 possible. La liaison du r\u00e9actif PicoGreen \u00ae<\/sup> \u00e0 l’ADNdb en est un exemple classique. Suite \u00e0 l’excitation du complexe \u00e0 l’aide d’une lumi\u00e8re d’une longueur d’onde sp\u00e9cifique (environ 480 nm pour PicoGreen), le fluorophore va \u00e9mettre une lumi\u00e8re de moindre \u00e9nergie, c’est-\u00e0-dire d’une longueur d’onde plus longue (environ 520 nm pour PicoGreen) (figure 1). La lumi\u00e8re est mesur\u00e9e en fluorescence relative (RFU), o\u00f9 l’intensit\u00e9 de la fluorescence est proportionnelle \u00e0 la concentration de l’\u00e9chantillon.<\/p>\n\n Quels mat\u00e9riaux sont n\u00e9cessaires pour cette m\u00e9thode ?<\/strong><\/p>\n\n La quantification des acides nucl\u00e9iques et des prot\u00e9ines b\u00e9n\u00e9ficie de la s\u00e9lection de colorants fluorescents qui se lient \u00e0 leur mol\u00e9cule cible respective avec une grande sp\u00e9cificit\u00e9. De plus, au moins un \u00e9talon de concentration connue doit \u00eatre disponible. L’excitation du fluorophore et la mesure de l’intensit\u00e9 de fluorescence de la lumi\u00e8re \u00e9mise n\u00e9cessitent soit un fluorom\u00e8tre autonome, soit un module de fluorescence int\u00e9gr\u00e9 dans un autre instrument. L’\u00e9quipement et le colorant fluorescent doivent \u00eatre compatibles afin que la source lumineuse \u00e0 l’int\u00e9rieur de l’instrument fournisse la ou les longueurs d’onde d’excitation requises et que le d\u00e9tecteur mesure la lumi\u00e8re \u00e9mise. Selon le type d’instrument, les solutions de r\u00e9actifs se trouvent soit dans des r\u00e9cipients de r\u00e9action \u00e0 parois minces, soit dans des cuvettes. La compatibilit\u00e9 avec l’application sp\u00e9cifique en ce qui concerne l’ajustement, la transparence, l’autofluorescence et le volume doit \u00eatre prise en consid\u00e9ration.<\/p>\n\n Comment se d\u00e9roule la m\u00e9thode ?<\/strong><\/p>\n\n La figure 2 montre la s\u00e9quence d’une mesure fluorim\u00e9trique. La pr\u00e9paration du blanc, des \u00e9talons et de l’\u00e9chantillon est initi\u00e9e par l’ajout du colorant fluorescent, suivi d’une courte p\u00e9riode d’incubation. Tout d’abord, un ou plusieurs standards de concentrations connues sont mesur\u00e9s afin de g\u00e9n\u00e9rer la courbe standard. La d\u00e9termination de la concentration de l’\u00e9chantillon a ensuite lieu dans une deuxi\u00e8me \u00e9tape, o\u00f9 les intensit\u00e9s de fluorescence mesur\u00e9es des \u00e9chantillons sont \u00e9valu\u00e9es par rapport \u00e0 la courbe standard.<\/p>\n\n Fluorescence \u2013 m\u00e9thode de choix ?<\/strong><\/p>\n\n M\u00eame si la fluorim\u00e9trie pr\u00e9sente des avantages dans certains cas, la spectrophotom\u00e9trie UV-Vis classique reste la m\u00e9thode standard en mati\u00e8re de quantification des acides nucl\u00e9iques et des prot\u00e9ines. La spectrophotom\u00e9trie permet de v\u00e9rifier la puret\u00e9 de l’\u00e9chantillon et les solutions hautement concentr\u00e9es peuvent \u00eatre analys\u00e9es directement. Selon la qualit\u00e9 de l’\u00e9chantillon, ainsi que les exigences des applications en aval, il peut \u00eatre conseill\u00e9 de combiner les deux techniques. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg\")