Les acides nucl\u00e9iques sont isol\u00e9s \u00e0 partir d’\u00e9chantillons tels que des cellules et ensuite utilis\u00e9s dans d’autres exp\u00e9riences de laboratoire. A cet effet, il convient de d\u00e9terminer la concentration de l’ADN ou de l’ARN purifi\u00e9 ainsi que de v\u00e9rifier leur puret\u00e9. De cette mani\u00e8re, des quantit\u00e9s d\u00e9finies avec pr\u00e9cision de l’acide nucl\u00e9ique entreront dans l’application en aval, et toute contamination susceptible d’avoir un impact sur une r\u00e9action ou un test sensible est d\u00e9tect\u00e9e en temps r\u00e9el.<\/p>\n\n
La spectrophotom\u00e9trie UV-Vis est une m\u00e9thode simple, rapide et \u00e9prouv\u00e9e pour atteindre ces objectifs. Dans la gamme de 260 nm, les acides nucl\u00e9iques pr\u00e9sentent un pic d’absorbance caract\u00e9ristique (figure 1). Cette valeur d’absorbance est donc utilis\u00e9e pour calculer les concentrations d’acides nucl\u00e9iques. Selon la loi de Lambert-Beer, deux param\u00e8tres sont n\u00e9cessaires pour le calcul de la concentration d’un \u00e9chantillon : la longueur du trajet optique (= longueur du trajet lumineux (L)) et le coefficient d’extinction molaire (constante sp\u00e9cifique au mat\u00e9riau et \u00e0 la longueur d’onde) du \u00e9chantillon \u00e0 mesurer. Le facteur sp\u00e9cifique (F) peut \u00eatre calcul\u00e9 lors de l’utilisation d’une cuvette standard avec un trajet lumineux de 1 cm. Ce facteur est ensuite multipli\u00e9 par la valeur d’absorbance mesur\u00e9e (A) pour arriver \u00e0 la concentration (C) de la solution d’\u00e9chantillon. Les coefficients d’extinction molaire et les facteurs sp\u00e9cifiques, respectivement, sont g\u00e9n\u00e9ralement disponibles dans la litt\u00e9rature. Le facteur pour l’ADNdb, par exemple, est de 50 \u00b5g\/mL (ARN : 40 \u00b5g\/mL), et il est par d\u00e9finition \u00e9quivalent \u00e0 une unit\u00e9 d’absorbance. ces donn\u00e9es.<\/p>\n\n Afin de pouvoir se prononcer sur la puret\u00e9 d’un \u00e9chantillon d’acide nucl\u00e9ique, l’absorbance \u00e0 des longueurs d’onde autres que 260 nm doit \u00eatre d\u00e9termin\u00e9e (figure 1). Les quotients issus des valeurs d’absorbance mesur\u00e9es \u00e0 260 nm, 280 nm et 230 nm (A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> et A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> ) constituent les rapports de puret\u00e9 qui permettent d’identifier d’\u00e9ventuelles contaminations. Les impuret\u00e9s telles que les prot\u00e9ines et les traces de r\u00e9actifs qui ont \u00e9t\u00e9 utilis\u00e9es pendant le processus de purification donnent un spectre d’absorbance diff\u00e9rent de celui des acides nucl\u00e9iques et influencent ainsi les rapports de puret\u00e9 (figure 2). Le rapport A260<\/sub> \/ A280<\/sub> des solutions d’acides nucl\u00e9iques purs sera approximativement de 1,8 \u00e0 2,0, tandis que le rapport A260<\/sub> \/ A230<\/sub> affichera typiquement des valeurs dans la plage de 2,0 \u00e0 2,5.<\/p>\n\n Une quatri\u00e8me longueur d’onde est utilis\u00e9e pour d\u00e9terminer le bruit de fond. Elle est mesur\u00e9e \u00e0 ou au-dessus de 320 nm car ni les acides nucl\u00e9iques ni les contaminants organiques n’absorbent la lumi\u00e8re \u00e0 cette longueur d’onde. L’absorbance mesur\u00e9e dans cette plage peut indiquer la pr\u00e9sence de particules ou de bulles d’air dans l’\u00e9chantillon. M\u00eame une cuvette tach\u00e9e est capable d’obtenir une lecture de fond. Les photom\u00e8tres modernes offrent la possibilit\u00e9 d’activer une fonction de correction de fond qui effectuera une soustraction automatique de toute absorbance de fond de toutes les autres valeurs mesur\u00e9es.<\/p>\n\n De plus, le spectre complet d’un \u00e9chantillon d’acide nucl\u00e9ique peut \u00eatre captur\u00e9 (typiquement entre 220 et 320 nm). Des comparaisons avec le spectre obtenu \u00e0 partir d’une solution d’acide nucl\u00e9ique pur permettront de d\u00e9tecter d’\u00e9ventuelles erreurs lors du processus de mesure ainsi que la pr\u00e9sence de contaminants dans l’\u00e9chantillon.<\/p>\n\nLoi de Lambert-Beer :<\/strong> C = concentration ![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\")
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