UV-Vis spektrofotomeetria ei ole v\u00e4ga tundlik \u2013 t\u00e4psete ja t\u00e4psete andmete saamiseks ei tohiks seet\u00f5ttu lasta proovide kontsentratsioonidel langeda alla teatud kontsentratsioonil\u00e4ve. DsDNA puhul on see alumine piir ligikaudu 1 \u00b5g\/ml. Isegi kui fotomeetri alumine tuvastuspiir ei ole saavutatud, on m\u00f5\u00f5tmise ebat\u00e4psuse m\u00f5ju selles vahemikus m\u00e4rkimisv\u00e4\u00e4rne ja sellest tulenevad v\u00e4\u00e4rtused v\u00f5ivad oluliselt muutuda. Fluoromeetriline anal\u00fc\u00fcs, mis on 1000 korda tundlikum kui neeldumismeetod, suudab v\u00e4ga t\u00e4pselt kvantifitseerida v\u00e4ga madala kontsentratsiooniga proovilahuseid.<\/p>\n\n
2. juhtum: kuidas saan teha t\u00e4pset kvantifitseerimist hoolimata proovi saastumisest?<\/strong><\/p>\n\n Lisaks nukleiinhapete kvantifitseerimisele 260 nm juures pakub UV-Vis spektrofotomeetria v\u00f5imalust m\u00e4\u00e4rata proovi puhtust, kasutades vastavalt t\u00e4iendavaid lainepikkusi (230 nm, 280 nm, 320 nm) v\u00f5i lainepikkuse skaneerimist. Andmete anal\u00fc\u00fcs v\u00f5imaldab teha j\u00e4reldusi selliste ainete, nagu sool, valgud v\u00f5i tahked osakesed, olemasolu kohta. Kui aga neeldumisspektrid on liiga sarnased, nagu erinevate nukleiinhapete puhul, ei suuda ainu\u00fcksi neeldumine eristada n\u00e4iteks RNA-d ja DNA-d. Sel juhul v\u00f5imaldavad fluorestsentsi m\u00f5\u00f5tmised anal\u00fc\u00fctide spetsiifilist kvantifitseerimist ilma teiste molekulide sekkumiseta.<\/p>\n\n Mis p\u00f5him\u00f5ttel see meetod p\u00f5hineb?<\/strong><\/p>\n\n Fluorestsentsm\u00f5\u00f5tmised kasutavad \u00e4ra n\u00e4htust, et teatud molekulid on v\u00f5imelised kiirgama energiat valguse kujul. Biomolekulide, nagu nukleiinhapped ja valgud, tuvastamiseks valitakse fluorestseeruv v\u00e4rv, mis seondub anal\u00fc\u00fcdiga v\u00f5imalikult suure spetsiifilisusega. Klassikaline n\u00e4ide on PicoGreen\u00ae reaktiivi sidumine dsDNA- ga<\/sup> . P\u00e4rast kompleksi ergastamist kindla lainepikkusega valgusega (ligikaudu 480 nm PicoGreeni puhul) kiirgab fluorofoor madalama energiaga valgust, st pikema lainepikkusega (ligikaudu 520 nm PicoGreeni puhul) (joonis 1). Valgust m\u00f5\u00f5detakse suhtelise fluorestsentsina (RFU), kus fluorestsentsi intensiivsus on v\u00f5rdeline proovi kontsentratsiooniga.<\/p>\n\n Milliseid materjale on selle meetodi jaoks vaja?<\/strong><\/p>\n\n Nukleiinhapete ja valkude kvantifitseerimine tuleb kasuks fluorestseeruvate v\u00e4rvainete valikust, mis seonduvad nende vastava sihtmolekuliga k\u00f5rge spetsiifilisusega. Lisaks peab olema saadaval v\u00e4hemalt \u00fcks teadaoleva kontsentratsiooniga standard. Fluorofoori ergastamiseks ja kiiratava valguse fluorestsentsi intensiivsuse m\u00f5\u00f5tmiseks on vaja kas eraldiseisvat fluoromeetrit v\u00f5i fluorestsentsmoodulit, mis on integreeritud teise seadmesse. Seadmed ja fluorestsentsv\u00e4rv peavad \u00fchilduma nii, et instrumendi sees olev valgusallikas annaks n\u00f5utava(d) ergastuslainepikkuse(d) ja detektor m\u00f5\u00f5daks kiiratavat valgust. Olenevalt instrumendi t\u00fc\u00fcbist paiknevad reaktiivilahused kas \u00f5hukeseseinalistes reaktsioonianumates v\u00f5i k\u00fcvettides. Arvesse tuleb v\u00f5tta sobivust konkreetse rakendusega sobivuse, l\u00e4bipaistvuse, automaatse fluorestsentsi ja mahu osas.<\/p>\n\n Kuidas meetodit teostatakse?<\/strong><\/p>\n\n Joonisel 2 on n\u00e4idatud fluoromeetrilise m\u00f5\u00f5tmise j\u00e4rjekord. Pimekatse, standardite ja proovi ettevalmistamine alustatakse fluorestsentsv\u00e4rvi lisamisega, millele j\u00e4rgneb l\u00fchike inkubatsiooniperiood. Esiteks m\u00f5\u00f5detakse \u00fcht v\u00f5i mitut teadaolevate kontsentratsioonidega standardit, et luua standardk\u00f5ver. Seej\u00e4rel m\u00e4\u00e4ratakse proovi kontsentratsioon teises etapis, kus proovide m\u00f5\u00f5detud fluorestsentsi intensiivsust hinnatakse standardk\u00f5vera suhtes.<\/p>\n\n Fluorestsents \u2013 valikmeetod?<\/strong><\/p>\n\n Isegi kui fluoromeetria pakub teatud juhtudel eeliseid, on klassikaline UV-Vis spektrofotomeetria endiselt standardmeetod nukleiinhapete ja valkude kvantifitseerimisel. Spektrofotomeetria v\u00f5imaldab kontrollida proovi puhtust ja v\u00e4ga kontsentreeritud lahuseid saab otse anal\u00fc\u00fcsida. S\u00f5ltuvalt proovi kvaliteedist ja j\u00e4rgnevate rakenduste n\u00f5uetest v\u00f5ib olla soovitatav kombineerida m\u00f5lemat tehnikat. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg\")