{"id":9797,"date":"2022-02-28T11:25:54","date_gmt":"2022-02-28T11:25:54","guid":{"rendered":"https:\/\/cotslab.com\/uv-vis-spektrofotomeetria-nukleiinhapete-lihtne-ja-kiire-kvantifitseerimine\/"},"modified":"2022-02-28T11:25:58","modified_gmt":"2022-02-28T11:25:58","slug":"uv-vis-spektrofotomeetria-nukleiinhapete-lihtne-ja-kiire-kvantifitseerimine","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cotslab.com\/et\/uv-vis-spektrofotomeetria-nukleiinhapete-lihtne-ja-kiire-kvantifitseerimine\/","title":{"rendered":"UV-Vis spektrofotomeetria \u2013 nukleiinhapete lihtne ja kiire kvantifitseerimine"},"content":{"rendered":"\n

Nukleiinhappelahuse neeldumise m\u00f5\u00f5tmisest vaid neljal lainepikkusel piisab selle kontsentratsiooni m\u00e4\u00e4ramiseks ja puhtuse kohta \u00fclevaate saamiseks.<\/p>\n\n

Pildi allikas: DRogatnev\/shutterstock.com<\/em><\/p>\n\n

Nukleiinhapped eraldatakse proovimaterjalist, n\u00e4iteks rakkudest, ja seej\u00e4rel kasutatakse neid edasistes laborikatsetes. Sel eesm\u00e4rgil on soovitatav m\u00e4\u00e4rata puhastatud DNA v\u00f5i RNA kontsentratsioon ja kontrollida nende puhtust. Sel viisil sisenevad t\u00e4pselt m\u00e4\u00e4ratletud kogused nukleiinhapet allavoolu rakendusse ja k\u00f5ik saasteained, mis v\u00f5ivad m\u00f5jutada tundlikku reaktsiooni v\u00f5i anal\u00fc\u00fcsi, tuvastatakse reaalajas.<\/p>\n\n

UV-Vis spektrofotomeetria on lihtne, kiire ja ajaproovitud meetod nende eesm\u00e4rkide saavutamiseks. 260 nm vahemikus on nukleiinhapetel iseloomulik neeldumispiik (joonis 1). Seet\u00f5ttu kasutatakse seda neeldumisv\u00e4\u00e4rtust nukleiinhapete kontsentratsioonide arvutamiseks. Lambert-Beeri seaduse j\u00e4rgi on proovi kontsentratsiooni arvutamiseks vaja kahte parameetrit: optilise tee pikkus (= valguse tee pikkus (L)) ja molaarne ekstinktsioonikoefitsient (materjali ja lainepikkuse spetsiifiline konstant). m\u00f5\u00f5detav proov. Spetsiifilise teguri (F) saab arvutada, kui kasutatakse standardset k\u00fcvetti, mille valgustee on 1 cm. Seej\u00e4rel korrutatakse see tegur m\u00f5\u00f5detud neeldumisv\u00e4\u00e4rtusega (A), et saada proovilahuse kontsentratsioon (C). Kirjanduses on tavaliselt saadaval vastavalt molaarsed ekstinktsioonikoefitsiendid ja spetsiifilised tegurid. N\u00e4iteks dsDNA tegur on 50 \u00b5g\/ml (RNA: 40 \u00b5g\/mL) ja see on definitsiooni j\u00e4rgi samav\u00e4\u00e4rne \u00fche neeldumis\u00fchikuga. need andmed.<\/p>\n\n

Lambert-Beeri seadus:<\/strong> C = A\/(L x \u0190 )<\/strong> F = 1\/\u0190<\/strong> (1 cm valgustee korral) – C = A x F<\/strong><\/td> C = Kontsentratsioon A = neeldumine L = optilise (valguse) tee pikkus \u0190 = molaarne ekstinktsioonikoefitsient (proovi ja lainepikkusep\u00f5hine) F = tegur<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n
\"\"
Joonis 1: Nukleiinhapete neeldumisspekter vastavate lainepikkustega ja n\u00e4ide, mis kirjeldab dsDNA proovi kontsentratsiooni arvutamist.<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n

Nukleiinhappeproovi puhtuse kohta v\u00e4ite tegemiseks tuleb m\u00e4\u00e4rata neeldumine lainepikkustel, mis ei ole 260 nm (joonis 1). 260 nm, 280 nm ja 230 nm juures m\u00f5\u00f5detud neeldumisv\u00e4\u00e4rtustest tuletatud jagatised (A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> ja A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> ) moodustavad puhtussuhted, mis aitavad tuvastada v\u00f5imalikke saasteaineid. Puhastusprotsessis kasutatud lisandid, nagu valgud ja reaktiivide j\u00e4ljed, annavad nukleiinhapete omast erineva neeldumisspektri ja m\u00f5jutavad seega puhtuse suhet (joonis 2). Puhaste nukleiinhappelahuste A260<\/sub> \/ A280<\/sub> suhe on ligikaudu 1,8\u20132,0, samas kui suhe A260<\/sub> \/ A230<\/sub> n\u00e4itab tavaliselt v\u00e4\u00e4rtusi vahemikus 2,0\u20132,5.<\/p>\n\n

\"\"
Joonis 2: Nukleiinhapete ja v\u00f5imalike saasteainete neeldumisspektrid<\/figcaption><\/figure>\n\n

Fooni m\u00e4\u00e4ramiseks kasutatakse neljandat lainepikkust. Seda m\u00f5\u00f5detakse 320 nm juures v\u00f5i k\u00f5rgemal, kuna ei nukleiinhapped ega orgaanilised saasteained ei neela sellel lainepikkusel valgust. Selles vahemikus m\u00f5\u00f5detud neeldumine v\u00f5ib viidata osakeste v\u00f5i \u00f5humullide olemasolule proovis. Isegi m\u00e4\u00e4rdunud k\u00fcvett on v\u00f5imeline esile kutsuma taustan\u00e4idu. Kaasaegsed fotomeetrid pakuvad v\u00f5imalust aktiveerida taustakorrektsiooni funktsioon, mis lahutab automaatse tausta neeldumise k\u00f5igist muudest m\u00f5\u00f5detud v\u00e4\u00e4rtustest.<\/p>\n\n

Lisaks v\u00f5ib p\u00fc\u00fcda kogu nukleiinhappeproovi spektrit (tavaliselt vahemikus 220\u2013320 nm). V\u00f5rdlus puhta nukleiinhappelahusega saadud spektriga v\u00f5imaldab tuvastada v\u00f5imalikke vigu m\u00f5\u00f5tmisprotsessi ajal ja ka saasteainete olemasolu proovis.<\/p>\n\n

Allikas<\/a><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Nukleiinhappelahuse neeldumise m\u00f5\u00f5tmisest vaid neljal lainepikkusel piisab selle kontsentratsiooni m\u00e4\u00e4ramiseks ja puhtuse kohta \u00fclevaate saamiseks. Pildi allikas: DRogatnev\/shutterstock.com Nukleiinhapped eraldatakse proovimaterjalist, n\u00e4iteks rakkudest, ja seej\u00e4rel kasutatakse neid edasistes laborikatsetes. Sel eesm\u00e4rgil on soovitatav m\u00e4\u00e4rata puhastatud DNA v\u00f5i RNA kontsentratsioon ja kontrollida nende puhtust. Sel viisil sisenevad t\u00e4pselt m\u00e4\u00e4ratletud kogused nukleiinhapet allavoolu rakendusse ja k\u00f5ik saasteained, […]\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[488],"tags":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9797"}],"collection":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=9797"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9797\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":9805,"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/9797\/revisions\/9805"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=9797"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=9797"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cotslab.com\/et\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=9797"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}