La espectrofotometr\u00eda UV-Vis no es muy sensible: para obtener datos exactos y precisos, no se debe permitir que las concentraciones de la muestra caigan por debajo de un cierto umbral de concentraci\u00f3n. Para dsDNA, este l\u00edmite inferior es de aproximadamente 1 \u00b5g\/mL. Incluso si no se ha alcanzado el l\u00edmite inferior de detecci\u00f3n del fot\u00f3metro, el impacto de la imprecisi\u00f3n de la medici\u00f3n en este rango es considerable y los valores resultantes pueden ser propensos a variaciones sustanciales. El an\u00e1lisis fluorom\u00e9trico, al ser 1000 veces m\u00e1s sensible que el m\u00e9todo de absorbancia, es capaz de cuantificar soluciones de muestra de concentraciones extremadamente bajas con mucha precisi\u00f3n.<\/p>\n\n
Caso 2: \u00bfC\u00f3mo puedo realizar una cuantificaci\u00f3n precisa a pesar de la contaminaci\u00f3n de la muestra?<\/strong><\/p>\n\n Adem\u00e1s de la cuantificaci\u00f3n de \u00e1cidos nucleicos a 260 nm, la espectrofotometr\u00eda UV-Vis ofrece la opci\u00f3n de determinar la pureza de la muestra empleando longitudes de onda adicionales (230 nm, 280 nm, 320 nm) o un escaneo de longitud de onda, respectivamente. El an\u00e1lisis de datos permitir\u00e1 sacar conclusiones sobre la presencia de sustancias como sal, prote\u00ednas o part\u00edculas s\u00f3lidas. Si, por el contrario, los espectros de absorbancia son demasiado similares, como es el caso de los diferentes \u00e1cidos nucleicos, la absorbancia por s\u00ed sola no podr\u00e1 distinguir entre, por ejemplo, ARN y ADN. En este caso, las medidas de fluorescencia permitir\u00e1n la cuantificaci\u00f3n espec\u00edfica de analitos, sin interferencia de otras mol\u00e9culas.<\/p>\n\n \u00bfEn qu\u00e9 principio se basa este m\u00e9todo?<\/strong><\/p>\n\n Las mediciones de fluorescencia aprovechan el fen\u00f3meno de que ciertas mol\u00e9culas son capaces de emitir energ\u00eda en forma de luz. Para la detecci\u00f3n de biomol\u00e9culas como \u00e1cidos nucleicos y prote\u00ednas, se selecciona un colorante fluorescente que se unir\u00e1 al analito con la mayor especificidad posible. La uni\u00f3n del reactivo PicoGreen \u00ae<\/sup> a dsDNA es un ejemplo cl\u00e1sico. Tras la excitaci\u00f3n del complejo utilizando luz de una longitud de onda espec\u00edfica (aproximadamente 480 nm para PicoGreen), el fluor\u00f3foro emitir\u00e1 luz de menor energ\u00eda, es decir, de una longitud de onda m\u00e1s larga (aproximadamente 520 nm para PicoGreen) (figura 1). La luz se mide como fluorescencia relativa (RFU), donde la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentraci\u00f3n de la muestra.<\/p>\n\n \u00bfQu\u00e9 materiales se requieren para este m\u00e9todo?<\/strong><\/p>\n\n La cuantificaci\u00f3n de \u00e1cidos nucleicos y prote\u00ednas se beneficia de la selecci\u00f3n de tintes fluorescentes que se unen a su respectiva mol\u00e9cula diana con alta especificidad. Adem\u00e1s, debe estar disponible al menos un est\u00e1ndar de concentraci\u00f3n conocida. La excitaci\u00f3n del fluor\u00f3foro y la medici\u00f3n de la intensidad de fluorescencia de la luz emitida requieren un fluor\u00f3metro independiente o un m\u00f3dulo de fluorescencia integrado en otro instrumento. El equipo y el tinte fluorescente deben ser compatibles para que la fuente de luz dentro del instrumento proporcione las longitudes de onda de excitaci\u00f3n requeridas y el detector mida la luz emitida. Seg\u00fan el tipo de instrumento, las soluciones de reactivos se encuentran en recipientes de reacci\u00f3n de pared delgada o en cubetas. Debe tenerse en cuenta la compatibilidad con la aplicaci\u00f3n espec\u00edfica con respecto al ajuste, la transparencia, la autofluorescencia y el volumen.<\/p>\n\n \u00bfC\u00f3mo se lleva a cabo el m\u00e9todo?<\/strong><\/p>\n\n La Figura 2 muestra la secuencia de una medici\u00f3n fluorom\u00e9trica. La preparaci\u00f3n del blanco, los est\u00e1ndares y la muestra se inicia con la adici\u00f3n del colorante fluorescente, seguida de un breve per\u00edodo de incubaci\u00f3n. Primero, se miden uno o m\u00e1s est\u00e1ndares de concentraciones conocidas para generar la curva est\u00e1ndar. Posteriormente, la determinaci\u00f3n de la concentraci\u00f3n de la muestra se lleva a cabo en un segundo paso, donde las intensidades de fluorescencia medidas de las muestras se eval\u00faan en relaci\u00f3n con la curva est\u00e1ndar.<\/p>\n\n Fluorescencia: \u00bfm\u00e9todo de elecci\u00f3n?<\/strong><\/p>\n\n Aunque la fluorometr\u00eda ofrece ventajas en determinados casos, la espectrofotometr\u00eda UV-Vis cl\u00e1sica sigue siendo el m\u00e9todo est\u00e1ndar en lo que respecta a la cuantificaci\u00f3n de \u00e1cidos nucleicos y prote\u00ednas. La espectrofotometr\u00eda permite la verificaci\u00f3n de la pureza de la muestra y las soluciones altamente concentradas se pueden analizar directamente. Dependiendo de la calidad de la muestra, as\u00ed como de los requisitos de las aplicaciones posteriores, puede ser recomendable combinar ambas t\u00e9cnicas. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg\")