Los \u00e1cidos nucleicos se a\u00edslan del material de muestra, como las c\u00e9lulas, y posteriormente se emplean en otros experimentos de laboratorio. Para ello, es recomendable determinar la concentraci\u00f3n del ADN o ARN purificado as\u00ed como verificar su pureza. De esta manera, cantidades definidas con precisi\u00f3n del \u00e1cido nucleico ingresar\u00e1n a la aplicaci\u00f3n posterior y cualquier contaminaci\u00f3n que pueda afectar una reacci\u00f3n o ensayo sensible se detecta en tiempo real.<\/p>\n\n
La espectrofotometr\u00eda UV-Vis es un m\u00e9todo f\u00e1cil, r\u00e1pido y probado para lograr estos objetivos. En el rango de 260 nm, los \u00e1cidos nucleicos muestran un pico de absorbancia caracter\u00edstico (figura 1). Por lo tanto, este valor de absorbancia se usa para calcular las concentraciones de \u00e1cido nucleico. De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, se requieren dos par\u00e1metros para el c\u00e1lculo de la concentraci\u00f3n de una muestra: la longitud del camino \u00f3ptico (= longitud del camino de la luz (L)) y el coeficiente de extinci\u00f3n molar (constante espec\u00edfica del material y de la longitud de onda) de la muestra a medir. El factor espec\u00edfico (F) se puede calcular utilizando una cubeta est\u00e1ndar con un paso de luz de 1 cm. Luego, este factor se multiplica por el valor de absorbancia medido (A) para llegar a la concentraci\u00f3n (C) de la soluci\u00f3n de muestra. Los coeficientes de extinci\u00f3n molar y los factores espec\u00edficos, respectivamente, suelen estar disponibles en la literatura. El factor para dsDNA, por ejemplo, es 50 \u00b5g\/mL (RNA: 40 \u00b5g\/mL), y es por definici\u00f3n equivalente a una unidad de absorbancia. estos datos.<\/p>\n\n Para poder hacer una afirmaci\u00f3n sobre la pureza de una muestra de \u00e1cido nucleico, se debe determinar la absorbancia a longitudes de onda distintas de 260 nm (figura 1). Los cocientes derivados de los valores de absorbancia medidos a 260 nm, 280 nm y 230 nm (A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> y A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> ) constituyen las relaciones de pureza que ayudan a identificar posibles contaminaciones. Las impurezas como prote\u00ednas y trazas de reactivos que se utilizaron durante el proceso de purificaci\u00f3n producen un espectro de absorbancia diferente al de los \u00e1cidos nucleicos y, por lo tanto, influyen en las proporciones de pureza (figura 2). La relaci\u00f3n A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> de soluciones de \u00e1cido nucleico puro ser\u00e1 de aproximadamente 1,8 – 2,0, mientras que la relaci\u00f3n A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> normalmente mostrar\u00e1 valores en el rango de 2,0 – 2,5.<\/p>\n\n Se utiliza una cuarta longitud de onda para determinar el fondo. Se mide a 320 nm o m\u00e1s, ya que ni los \u00e1cidos nucleicos ni los contaminantes org\u00e1nicos absorben la luz a esta longitud de onda. La absorbancia medida en este rango puede indicar la presencia de part\u00edculas o burbujas de aire dentro de la muestra. Incluso una cubeta manchada es capaz de obtener una lectura de fondo. Los fot\u00f3metros modernos ofrecen la opci\u00f3n de activar una funci\u00f3n de correcci\u00f3n de fondo que efectuar\u00e1 la resta autom\u00e1tica de cualquier absorbancia de fondo de todos los dem\u00e1s valores medidos.<\/p>\n\n Adem\u00e1s, se puede capturar el espectro completo de una muestra de \u00e1cido nucleico (t\u00edpicamente entre 220 y 320 nm). Las comparaciones con el espectro obtenido de una soluci\u00f3n de \u00e1cido nucleico puro permitir\u00e1n detectar posibles errores durante el proceso de medici\u00f3n, as\u00ed como la presencia de contaminantes en la muestra.<\/p>\n\nLey de Lambert-Beer:<\/strong> C = Concentraci\u00f3n ![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\")
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