UV-Vis-spektrofotometrio ne estas tre sentema – por akiri precizajn kaj precizajn datenojn, specimenaj koncentri\u011doj devus do ne esti permesitaj fali sub certa koncentri\u011dsojlo. Por dsDNA, tiu pli malalta limo estas proksimume 1 \u00b5g\/mL. E\u0109 se la malsupra limo de detekto de la fotometro ne estis atingita, la efiko de mezurmalprecizeco en tiu intervalo estas konsiderinda, kaj rezultaj valoroj povas esti emaj al granda vario. Fluorometria analizo, estante 1000-oble pli sentema ol la absorbadmetodo, kapablas kvantigi prova\u0135solvojn de ekstreme malaltaj koncentri\u011doj tre precize.<\/p>\n\n
Kazo 2: Kiel mi povas plenumi precizan kvantigon malgra\u016d specimena poluado?<\/strong><\/p>\n\n Aldone al kvantigo de nukleaj acidoj je 260 Nm, UV-Vis-spektrofotometrio ofertas la opcion de determinado de prova\u0135opureco uzante kromajn ondolongojn (230 Nm, 280 Nm, 320 Nm), a\u016d ondolongskanadon, respektive. Analizo de datumoj permesos konkludojn pri la \u0109eesto de substancoj kiel salo, proteinoj a\u016d solidaj partikloj. Se, aliflanke, la absorbadspektroj estas tro similaj, kiel estas la kazo por la malsamaj nukleaj acidoj, absorbo sole ne povos distingi inter, ekzemple, RNA kaj DNA. En \u0109i tiu kazo, fluoreskecaj mezuradoj permesos la specifan kvantigon de analitoj, sen interfero de aliaj molekuloj.<\/p>\n\n Sur kiu principo bazi\u011das tiu \u0109i metodo?<\/strong><\/p>\n\n Fluoreskmezuradoj ekspluatas la fenomenon ke certaj molekuloj kapablas elsendi energion en formo de lumo. Por la detekto de biomolekuloj kiel ekzemple nukleaj acidoj kaj proteinoj, fluoreska tinkturfarbo estas elektita kiu ligos al la analito kun la plej alta ebla specifeco. La ligo de la reakciilo PicoGreen \u00ae<\/sup> al dsDNA estas klasika ekzemplo. Post ekscito de la komplekso uzante lumon de specifa ondolongo (\u0109irka\u016d 480 nm por PicoGreen), la fluoroforo elsendos lumon de pli malalta energio, te de pli longa ondolongo (\u0109irka\u016d 520 nm por PicoGreen) (figuro 1). La lumo estas mezurita kiel relativa fluoreskeco (RFU), kie la intenseco de la fluoreskeco estas proporcia al la koncentri\u011do de la prova\u0135o.<\/p>\n\n Kiuj materialoj estas bezonataj por \u0109i tiu metodo?<\/strong><\/p>\n\n Kvantigo de nukleaj acidoj kaj proteinoj profitas el la elekto de fluoreskaj tinkturfarboj kiuj ligas al sia respektiva celmolekulo kun alta specifeco. Krome, almena\u016d unu normo de konata koncentri\u011do devas esti havebla. Ekscito de la fluoroforo kaj mezurado de la fluoreskecintenseco de la elsendita lumo postulas a\u016d memstaran fluorometron a\u016d fluoreskecmodulon kiu estas integrita ene de alia instrumento. Ekipa\u0135o kaj fluoreska tinkturfarbo devas esti kongruaj tiel ke la lumfonto ene de la instrumento disponigas la postulatan ekscitlongon (j) kaj la detektilo mezuras la lumon elsenditan. Depende de la speco de instrumento, la reakciigsolvoj situas a\u016d en maldikmuraj reagujoj a\u016d en kuvetoj. Kongruo kun la specifa apliko rilate al ta\u016dgeco, travidebleco, a\u016dto-fluoresko kaj volumeno devas esti konsiderata.<\/p>\n\n Kiel estas efektivigita la metodo?<\/strong><\/p>\n\n Figuro 2 montras la sekvencon de fluorometria mezurado. Preparado de la malplena, la normoj kaj la specimeno estas komencita per aldono de la fluoreska tinkturfarbo, sekvita de mallonga inkubacio. Unue, unu a\u016d pluraj normoj de konataj koncentri\u011doj estas mezuritaj por generi la norman kurbon. Determino de specimena koncentri\u011do poste okazas en dua pa\u015do, kie la mezuritaj fluoreskecaj intensecoj de la prova\u0135oj estas taksitaj rilate al la norma kurbo.<\/p>\n\n Fluoresko – elektebla metodo?<\/strong><\/p>\n\n E\u0109 se fluorometrio ofertas avanta\u011dojn en certaj kazoj, klasika UV-Vis-spektrofotometrio da\u016dre estas la norma metodo kiam \u011di venas al kvantigado de nukleaj acidoj kaj proteinoj. Spektrofotometrio permesas konfirmon de prova\u0135opureco, kaj tre densaj solvoj povas esti analizitaj rekte. Depende de la kvalito de la specimeno, same kiel de la postuloj de kontra\u016dfluaj aplikoj, povas esti konsilinde kombini amba\u016d teknikojn. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Workflow-fluorescence.jpg\")