Die UV-Vis-Spektrophotometrie ist nicht sehr empfindlich \u2013 um genaue und pr\u00e4zise Daten zu erhalten, sollten Probenkonzentrationen daher eine bestimmte Konzentrationsschwelle nicht unterschreiten. F\u00fcr dsDNA liegt diese untere Grenze bei etwa 1 \u00b5g\/ml. Auch wenn die untere Nachweisgrenze des Photometers noch nicht erreicht ist, ist der Einfluss der Messungenauigkeit in diesem Bereich erheblich und die resultierenden Werte k\u00f6nnen erheblichen Schwankungen unterliegen. Die fluorometrische Analyse, die 1000-mal empfindlicher ist als die Absorptionsmethode, ist in der Lage, Probenl\u00f6sungen mit extrem niedrigen Konzentrationen sehr genau zu quantifizieren.<\/p>\n\n
Fall 2: Wie kann ich trotz Probenkontamination eine genaue Quantifizierung durchf\u00fchren?<\/strong><\/p>\n\n Neben der Quantifizierung von Nukleins\u00e4uren bei 260 nm bietet die UV-Vis-Spektrophotometrie die M\u00f6glichkeit, die Probenreinheit durch zus\u00e4tzliche Wellenl\u00e4ngen (230 nm, 280 nm, 320 nm) bzw. einen Wellenl\u00e4ngenscan zu bestimmen. Die Datenanalyse erlaubt R\u00fcckschl\u00fcsse auf das Vorhandensein von Stoffen wie Salz, Proteinen oder Feststoffpartikeln. Wenn andererseits die Absorptionsspektren zu \u00e4hnlich sind, wie es bei den verschiedenen Nukleins\u00e4uren der Fall ist, kann die Absorption allein nicht zwischen beispielsweise RNA und DNA unterscheiden. In diesem Fall erm\u00f6glichen Fluoreszenzmessungen die spezifische Quantifizierung von Analyten ohne St\u00f6rung durch andere Molek\u00fcle.<\/p>\n\n Auf welchem Prinzip basiert diese Methode?<\/strong><\/p>\n\n Fluoreszenzmessungen machen sich das Ph\u00e4nomen zunutze, dass bestimmte Molek\u00fcle Energie in Form von Licht abgeben k\u00f6nnen. F\u00fcr den Nachweis von Biomolek\u00fclen wie Nukleins\u00e4uren und Proteinen wird ein Fluoreszenzfarbstoff ausgew\u00e4hlt, der mit m\u00f6glichst hoher Spezifit\u00e4t an den Analyten bindet. Die Bindung des Reagenzes PicoGreen \u00ae<\/sup> an dsDNA ist ein klassisches Beispiel. Nach Anregung des Komplexes mit Licht einer bestimmten Wellenl\u00e4nge (ca. 480 nm f\u00fcr PicoGreen) emittiert der Fluorophor Licht geringerer Energie, dh l\u00e4ngerer Wellenl\u00e4nge (ca. 520 nm f\u00fcr PicoGreen) (Abbildung 1). Das Licht wird als relative Fluoreszenz (RFU) gemessen, wobei die Intensit\u00e4t der Fluoreszenz proportional zur Konzentration der Probe ist.<\/p>\n\n Welche Materialien werden f\u00fcr diese Methode ben\u00f6tigt?<\/strong><\/p>\n\n Die Quantifizierung von Nukleins\u00e4uren und Proteinen profitiert von der Auswahl an Fluoreszenzfarbstoffen, die mit hoher Spezifit\u00e4t an ihr jeweiliges Zielmolek\u00fcl binden. Au\u00dferdem muss mindestens ein Standard mit bekannter Konzentration verf\u00fcgbar sein. Die Anregung des Fluorophors und die Messung der Fluoreszenzintensit\u00e4t des emittierten Lichts erfordern entweder ein eigenst\u00e4ndiges Fluorometer oder ein Fluoreszenzmodul, das in ein anderes Instrument integriert ist. Ausr\u00fcstung und Fluoreszenzfarbstoff m\u00fcssen kompatibel sein, damit die Lichtquelle im Ger\u00e4t die erforderliche(n) Anregungswellenl\u00e4nge(n) liefert und der Detektor das emittierte Licht misst. Je nach Ger\u00e4tetyp befinden sich die Reagenzl\u00f6sungen entweder in d\u00fcnnwandigen Reaktionsgef\u00e4\u00dfen oder in K\u00fcvetten. Die Kompatibilit\u00e4t mit der spezifischen Anwendung hinsichtlich Passform, Transparenz, Autofluoreszenz und Volumen muss ber\u00fccksichtigt werden.<\/p>\n\n Wie wird die Methode durchgef\u00fchrt?<\/strong><\/p>\n\n Abbildung 2 zeigt den Ablauf einer fluorometrischen Messung. Die Vorbereitung des Blindwerts, der Standards und der Probe wird durch die Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs eingeleitet, gefolgt von einer kurzen Inkubationszeit. Zuerst werden ein oder mehrere Standards bekannter Konzentrationen gemessen, um die Standardkurve zu erzeugen. Anschlie\u00dfend erfolgt in einem zweiten Schritt die Bestimmung der Probenkonzentration, bei der die gemessenen Fluoreszenzintensit\u00e4ten der Proben in Relation zur Standardkurve ausgewertet werden.<\/p>\n\n Fluoreszenz \u2013 Methode der Wahl?<\/strong><\/p>\n\n Auch wenn die Fluorometrie in bestimmten F\u00e4llen Vorteile bietet, ist die klassische UV-Vis-Spektrophotometrie nach wie vor die Standardmethode, wenn es um die Quantifizierung von Nukleins\u00e4uren und Proteinen geht. Die Spektrophotometrie erm\u00f6glicht die \u00dcberpr\u00fcfung der Probenreinheit, und hochkonzentrierte L\u00f6sungen k\u00f6nnen direkt analysiert werden. Abh\u00e4ngig von der Qualit\u00e4t der Probe sowie den Anforderungen nachgelagerter Anwendungen kann es sinnvoll sein, beide Techniken zu kombinieren. <\/p>\n\n![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/Principle-of-fluorescence-measurements-of-nucleic-acids-left.jpg\")
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